Analizirali smo vpliv sotopljencev (sečnina in trimetilamin-N-oksid (TMAO)) na porazdelitev preferenčnih konformacij (PII, αR in β) v izbranih dipeptidih in glutationu (GSH; γ-Glu-Cys-Gly). Vpliv sotopljencev na konformacijo peptidnega skeleta v območju amida III in velikost 3J(HN, Hα) sklopitvene konstante dipeptidov je zanemarljiv. Opazimo pa visoko povečanje 3J(HN, Hα) sklopitvene konstante Ala in Val dipeptida v nepolarnem topilu tetraklorometan v primerjavi z vodnimi raztopinami sotopljencev. Populacija β konformacije Ala in Gly dipeptida v območju amida III se poveča. Molekule TMAO preorientirajo strukturo vode v hidratacijskem plašču GSH, da lahko le-ta ohrani obstoječo konformacijo (indirekten vpliv). Vpliv na spremembo konformacije GSH opazimo v primeru sečnine. GSH je eden glavnih virov neproteinskega žvepla za kompleksacijo Cd2+. Deprotonirana karboksilna skupina COO- glutaminske kisline in tiolna skupina S- cisteina stabilizirata Cd2+•••GSH kompleks s interakcijo s pozitivno nabitim Cd2+. Vezava Cd2+ na stransko verigo cisteina pri nevtralni pH vrednosti je posledica prenosa protona s tiolne SH skupine na deprotonirano karboksilno skupino COO- glicina. Nastanek kompleksa Cd2+•••GSH vpliva na konformacijo peptidnega skeleta GSH v območju amida III. Ob povečanju deleža Cd2+ v raztopini GSH se je populacija β konformacije zmanjšala na račun povečanja populacije PII. Izolirali smo tudi kloroplastno obliko karboanhidraze iz listov modrikastega mošnjaka (T. caerulescens J. & C. Presl). Z določanjem zaporedja izolirane karboanhidraze iz modrikastega mošnjaka tretiranega s Cd oz. Zn in poravnavo aminokislinskih ostankov s predstavniki različnih razredov karboanhidraz smo testirali možnost zamenjave kovine (Zn s Cd) v aktivnem mestu encima. Analiza je pokazala na popolno ohranitev ligandov Zn atoma in ostalih aminokislinskih ostankov, ki sodelujejo pri vezavi substrata v aktivnem mestu encima. Prisotnost Zn v izolirani karboanhidrazi iz modrikastega mošnjaka tretiranega s Cd smo dodatno potrdili z tehniko laserske ablacije in induktivno sklopljene plazme z masno spektrometrijo.
D.09 Mentorstvo doktorandom
COBISS.SI-ID: 762743Doktorska disertacija posega na področje mikroskopske slike hidrofobne interakcije, ki je izjemnega pomena pri razumevanju procesov v molekularni biofiziki. Rezultati temeljijo na atomističnih Monte-Carlo simulacijah vode in generičnih modelov topljencev ob uporabi metod klasične statistične mehanike. V delu je predstavljena vrsta inovativnih metodoloških pristopov ter obsežne in skrbno izvedene analize kot tudi teoretske novosti, ki bistveno dopolnjujejo obstoječo fizikalno sliko hidrofobnega efekta. V delu je nedvoumno pokazano, da je konsistenten opis hidrofobnega efekta možen le ob upoštevanju večdelčnih korelacij med molekulami vode. Glavne rezultate in ugotovitve doktorskega dela je mogoče zajeti v štiri sklope, ki so kritično umeščeni v kontekst obstoječih dognanj in med katerimi vsak posebej predstavlja tudi odlično izhodišče za nadaljnje raziskave. Obravnava: i) odziv molekul vode na naraščajočo polarno motnjo modelnih topljencev, ii) mikroskopski izvor padca entropije pri hidrofobni hidrataciji, iii) vlogo večdelčnih korelacij pri interakciji med dvema hidrofobnima topljencema ter uvede iv) koncept lokalne termodinamike kot najprimernejšega orodja za opis lokalnih nehomogenosti v tekočinah.
D.09 Mentorstvo doktorandom
COBISS.SI-ID: 2418788Razvoj novih protibakterijskih učinkovin je eden od najpomembnejših ukrepov v boju proti naraščajoči bakterijski odpornosti. Ligaza MurD je esencialen bakterijski encim, ki predstavlja privlačno tarčo za razvoj novih protibakterijskih učinkovin. Naše raziskave so bile usmerjene v določanje načina vezave novih inhibitorjev ligaze MurD. Za določanje vezavnih mest ligandov smo uporabili 1H/13C HSQC NMR eksperimente na proteinu MurD, selektivno 13C označenem na metilnih skupinah Ile (δ1), Val in Leu. S primerjavo vzorcev sprememb kemijskih premikov pri vezavi strukturno različnih ligandov smo določili ključne metilne signale v aktivnem mestu. Konformacijske lastnosti smo raziskovali z uporabo NMR eksperimentov prenesenega NOE efekta. Kontakte liganda s proteinom smo proučevali z metodo diferenčnega prenosa saturacije (STD NMR). Način vezave smo študirali tudi z simulacijami molekulske dinamike (MD) v programu CHARMM. Opazili smo različne stopnje fleksibilnosti ligandov, ki vplivajo na interakcije ligand-protein. Metodologija, ki smo jo razvili, je uporabna tudi za študije ostalih muramilnih ligaz ali receptorjev podobne velikosti.
D.09 Mentorstvo doktorandom
COBISS.SI-ID: 5099802Predstavila sem našo strategijo načrtovanja novih protibakterijskih terapevtikov, ki temelji na izboljšavi strukturno podprtih metod načrtovanja učinkovin, vpeljavi novih proteinskih tarč in razvoju inhibitorjev, ki delujejo na več tarč hkrati. Podala sem celovit pregled rezultatov naših NMR zasnovanih raziskav načina vezave različnih vrst inhibitorjev muramilnih ligaz. Izpostavila sem naše nedavno odkritje kompleksnih dinamičnih procesov v kompleksih ligand-encim in njihovega vpliva na biološko aktivnost ligandov.
B.04 Vabljeno predavanje
COBISS.SI-ID: 5059354Simona Golič Grdadolnik, Jože Grdadolnik in Franci Merzel so mentorji petim doktorandom
D.10 Pedagoško delo