Šikonin je lipofilna spojina, ki se nahaja v koreninah rastline Lithospermum erythrorhizon in jo zaradi raznovrstnih učinkov uporabljajo v tradicionalni kitajski medicini. Zanimalo nas je, ali so opaženi antipiretični in protivnetni učinki lahko posledica inhibicije inflamasoma NLRP3. Inflamasomi so multiproteinski kompleksi za aktivacijo kaspaze-1, slednja pa sproži zorenje vnetnih citokinov IL-1β in IL-18. Aktivacija inflamasoma NLRP3 poteka v dveh korakih. Šikonin inhibira tako prvi korak (aktivacijo NF-κB), kot tudi drugi korak, to je sestavljanje inflamasoma, ki ga povzročijo različni tipi aktivatorjev. Pokazali smo, da je v inhibiciji inflamasoma NLRP3 šikonin učinkovitejši kot acetilšikonin. Šikonin je inhibiral tudi aktivacijo inflamasoma AIM2 z dvoverižno DNA. Nadalje smo pokazali, da šikonin prepreči aktivacijo kaspaze-1 in deluje tudi direktno na kaspazo-1. Ker je šikonin preprečil tudi tvorbo agregatov adaptorja ASC, ki potekajo pred aktivacijo kaspaze-1, ugotavljamo, da lahko šikonin deluje na različnih stopnjah aktivacije inflamasomov. Pokazali smo tudi, da kompleksi šikonina z beta-laktoglobulinom ob manjši toksičnosti še vedno učinkovito inhibirajo aktivacijo inflamasoma, kar nakazuje, da so lahko oblike šikonina z izboljšano biološko uporabnostjo zanimive za terapevtske aplikacije v bolezenskih stanjih, ki jih povezujejo z inflamasomi.
COBISS.SI-ID: 5952026
Inflamasom NLRP3 je multiproteinska platforma za aktivacijo kaspaze-1. Kljub naraščajočim številom poročil, ki odkrivajo pomembno vlogo NLRP3 v različnih boleznih, mehanizem aktivacije NLRP3 še vedno ni poznan, predvsem so nejasne začetne stopnje, ki so ključne za sestavljanje inflamasomskega kompleksa. V študiji smo želeli določiti minimalno oligomerizacijsko stopnjo NLRP3, potrebno za aktivacijo inflamasoma NLRP3. V ta namen smo pripravili konstrukte, v katerih pirinsko domeno NLRP3 povezujemo v dimer ali trimer. Konstrukte so stabilno vnesli v mišje makrofage, ki ne izražajo endogenega NLRP3 in izražanje sprožili z dodatkom doksiciklina. Pokazali smo, da dimerizacija pirinskih domen bodisi v paralelni ali antiparalelni orientaciji ne zadostuje za aktivacijo inflamasoma. Trimerizacija pirinskih domen pa povzroči močno zorenje IL-1b, ki je odvisno od kaspaze-1, poteka pa v odsotnosti velikih agregatov adaptorskega proteina ASC. Konstitutivne aktivacije preko trimerizacije ne moremo inhibirati s specifičnim inhibitorjem NLRP3 MCC950, kar je pričakovano, saj ta inhibitor deluje na neznano tarčo v začetni stopnji sestavljanja inflamasoma. Čeprav ne moremo izključiti, da NLRP3 divjega tipa, podobno kot NLRP1 ali NLRC4 tvori oligomere višje stopnje, naši rezultati demonstrirajo, da učinkovito zorenje IL-1β dosežemo že s trimerizacijo pirinskih domen NLRP3.
COBISS.SI-ID: 6095642
Vodja projekta je prispevala dva recenzirana pregledna članka na temo inflamasomov (The NLRC4 inflammasome: The pieces of the puzzle are falling into place) in multiproteinskih kompleksov s posebnim razdelkom o signalnih kompleksih ter njihovem razširjanju med celicami (Prions, prionoid complexes and amyloid: the bad, the good and something in between).
COBISS.SI-ID: 6108698
Oksidativni stres je univerzalen znak odziva na okužbo ali sterilno poškodbo in aktivira naravni imunski odziv. Ekstracelularni vezikli (EV) iz plazme bolnikov z revmatoidnim artritisom ali celic, ki so bile izpostavljene oksidativnemu stresu, aktivirajo TLR4/MD2 preko oksidiranih fosfolipidov (oxPL). EV iz zdravih oseb ali sintetično pripravljeni EV so bili spremenjeni v agoniste TLR4 z delno oksidacijo, hkrati pa je dolgotrajna oksidacija uničila aktivacijo TLR4. Poleg tega smo opredelili 15-lipoksigenazo kot nov encimski generator agonistov TLR4, ter pokazali, da so hidroperoksidirani PL endogeni agonisti TLR4. Aktivacija TLR4 z oxPL iz EV posnema molekularni mehanizem aktivacije TLR4 z lipopolisaharidom (LPS), kar smo pokazali z vlogo MD-2, mutacijami vezavnega mesta TLR4 in dimerizacijo receptorskega kompleksa. Vendar pa transkripcijski profil odziva BMDM-jev na patogeni signal (LPS) in endogeni signal nevarnosti (EV) ni dal enakega rezultata. Pri EV smo opazili komponento, ki vodi v prenehanje vnetja. Rezultati opredeljujejo EV kot oksidativni endogeni signal nevarnosti in potrjujejo zelo raznoliko vlogo receptorja TLR4.
COBISS.SI-ID: 5706266
Pretvorba prionskega proteina (PrP) je ključni dogodek pri prionskih boleznih, vendar pa je mehanizem tega procesa še vedno neznan. V študiji smo preučevali, kako na pretvorbo vplivajo patološke mutacije in sprememba pH. Pokazali smo, da patološke mutacije pospešijo pretvorbo. Raziskovali smo tudi vpliv pH in pokazali, da je za pretvorbo PrP ob znižanju pH ključna protonacija histidina 187. Če smo slednjega zamenjali za tirozinski aminokislinski ostanek, smo pretvorbo zelo upočasnili. Načrtali smo tudi dodatne histidinske ostanke, ki so imeli podoben vpliv kot H187 le, kadar so se nahajali na interakcijski površini med poddomenama, ne pa kadar so se nahajali na površini proteina. Opazili smo močno povezavo med stabilnostjo nativne strukture in kinetiko pretvorbe PrP. Naši rezultati demonstrirajo, da patološke mutacije olajšajo ločitev poddomen in nakazujejo, da bi bilo povečanje stabilnosti nativne strukture smiselna strategija pri razvoju novih terapij še neozdravljivih prionskih bolezni.
COBISS.SI-ID: 5610266