Karcinogenezo uretana (etil karbamata) stranskega produkta fermentacije prisotnega v velikem številu prehranskih produktov smo proučevali s kombinacijo kinetičnih eksperimentov ter kvantnomehanskih izračunov. Glavni cilj študije je bil identificirati aktivacijsko prosto energijo ΔGa najpočasnejšega koraka SN2 substitucije med vinil karbamat epoksidom VCE (končnim karcinogenom uretana) ter različnimi nukleobazami DNA. V eksperimentalnem delu smo določili konstanto reakcijske hitrosti drugega reda za tvorbo glavnega 7-(2-oksoetil)gvanin adukta v vodni raztopini deoksigvanozina ter DNA. S serijo ab initio, DFT in semiempiričnih MO izračunov smo nato določili aktivacijske bariere za reakcijo VCE z metilgvaninom, metiladeninom ter metilcitozinom. Efekte solvatacije smo vključili preko modelov reakcijskega polja topila ter Langevinovih dipolov. Izračunani rezultati za glavni adukt so se odlično ujemali z eksperimentom, kar predstavlja močno potrditev veljavnosti predlaganega SN2 reakcijskega mehanizma. Posledično smo lahko napovedali aktivacijske bariere za nastanek stranskih aduktov, za katere kinetični eksperimenti še niso bili izvedeni. Naši izračuni res kažejo na preferenčno tvorbo glavnega 7-(2-oksoetil)gvanin adukta, saj morajo stranski adukti za svoj nastanek bodisi prečiti znatno višjo aktivacijsko pregrado bodisi razpreti Watson-Crickove bazne pare DNA. Računalniška študija je obravnavala tudi vprašanje stereoselektivnosti, lahkote eliminacije odhajajoče skupine ter relativnih prispevkov dveh možnih reakcijskih poti za nastanek 1,N2-etenodeoksigvanozin adukta.
COBISS.SI-ID: 5643802
Monomerna piranozna dehidrogenaza Agaricus meleagris (AmPDH) spada v družino oksidoreduktaz glukoze-metanola-holina. FAD kofaktor je kovalentno vezan na His103 encima. AmPDH lahko dvakrat oksidira številne mono- ter oligosaharide na različnih mestih (C1 do C4). Z namenom obravnave odnosa med strukturo in funkcijo izbranih aminokislinskih preostankov v aktivnem mestu AmPDH, smo generirali več encimskih mutant, jih heterologno izrazili s pomočjo Pichia pastoris ter jih karakterizirali z uporabo biokemijskih, biofizikalnih in računalniških tehnik. Kristalna struktura AmPDH v aktivnem mestu vsebuje dva histidina, ki bi oba lahko prevzela vlogo katalitske baze v reduktivni polreakciji. Ravnotežna kinetika razkriva, da His512 predstavlja edino katalitsko bazo, saj mutanta H512A zmanjša (kcat/KM)glukoze za faktor 10^5, medtem ko je katalitska učinkovitost mutant H556A in H556N upadla zgolj za 2-3 velikostne rede. Te ugotovitve smo nadalje potrdili z uporabo kinetike prehodnega stanja, kjer smo pri mutanti H556A opazili podoben upad reduktivne konstante hitrosti, medtem ko se je konstanta hitrosti za oksidacijsko polreakcijo (z benzokinonom kot substratom) celo povečala v primerjavi z wild-type AmPDH. Ravnotežna kinetika je nadalje razkrila tudi Gln392, Tyr510, Val511 ter His556 kot pomembne aminokislinske preostanke za katalitično učinkovitost PDH. Simulacije molekulske dinamike sklopljene s prosto-energijskimi izračuni smo uporabili za napoved oksidacijskih mest na substratu D-glukoze, kar smo preverili z GC-MS meritvami. Te simulacije tudi nakazujejo, da van der Waalsove interakcije predstavljajo gonilno silo prepoznavanja in vezave molekul substrata.
COBISS.SI-ID: 5765402
Neizpodbitno smo dokazali, da defektna sinteza holesterola predstavlja neodvisno determinanto vnetja jeter in fibroze. Pripravili smo miši z izbitim hepatospecifičnim genom za lanosterol 14 a-demetilazo (cyp51) iz dela holesterolne sinteze, ki že vodi do holesterola. Te miši so razvile hepatomegalijo s proliferacijo ovalnih celic, fibrozo in vnetjem, a brez steatoze. Glavno stikalo predstavljajo reducirani holesterolni estri, ki so spodbudili zastoj celičnega cikla, z njim povezani sekretorni fenotip in končni odziv v obliki ovalnih celic, medtem ko dvignjeni nivoji CYP51 substratov spodbujajo integralni stresni odziv. Čeprav je ovalno-celična fibroza histološko podobna pri obeh spolih, podatki kažejo negativno regulacijo poti primarnega metabolizma pri ženskem ter močnejši imunski odziv pri moškem spolu. Poškodba jeter je bila omiljena ob vnosu prehranskih maščob predvsem pri ženskah, medtem ko je vnos prehranskega holesterola odpravil fibrozo pri obeh spolih. Naša študija tako postavlja defektno sintezo holesterola v samo žarišče od spola odvisnih jeternih patologij.
COBISS.SI-ID: 31858137