V kvasovki Saccharomyces cerevisiae smo vspostavili dereguliran metabolni pretok preko glikolize z vnosom gena za visoko aktiven kratek fragment humane 6-fosfofrukto-1-kinaze (Pfk), ki pri rakastih celicah povzroči deregulacijo glikolize. Z nadaljnjo optimizacijo gojenja transformant smo uspeli določiti pogoje, kjer transformanta z modificiranim Pfk encimom raste hitreje kot transformanta z nativnim humanim encimom. Transformanta S.cerevisiae, ki nosi gen za modificiran Pfk encim bi bila lahko primerna za študij spremenjenega energetskega metabolizma pri raku (Warburgov efekt).
F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije
COBISS.SI-ID: 37878533Eno od pomembnih vprašanj glede delovanja metformina na rakave celice je torej, ali metformin deluje neposredno na rakave celice že pri nizkih, mikromolarnih koncentracijah. Ugotovili smo, da visoke koncentracije metformina (5 mM) pri fiziološki koncentraciji glukoze v gojišču nimajo vpliva na celice MDA-MB-231 kar je v nasprotju z nekaterimi raziskavami. Medtem ko v odsotnosti glukoze metformin zavre proliferacijo MDA-MB-231 celic že pri cca. 300 µM koncentraciji. Nekonsistentnost med raziskavami smo pojasnili z upadanjem hranil v gojišču pri daljšem gojenju celic brez menjave gojišča (3 dni). Celice porabljajo hranila (npr. glukozo) kar vpliva na učinek metformina na MDA-MB-231 celice. Učinek je večji pri večji gostoti celic in se da preprečiti z vsakodnevno menjavo gojišča. Da bi simulirali pomanjkanje glukoze v gojišču smo celice MDA-MB-231 tretirali hkrati z metforminom in inhibitorjem glikolize 2-deoksi glukozo (2-DG). 2-DG so že uporabili v klinični raziskavi (tip 1 in 2.) Mi smo pri poskusih na celice MDA-MB-231 v kulturi uporabili koncentracijo 2-DG, ki se jo lahko doseže v serumu pacientov. Metformin je imel učinek na proliferacijo MDA-MB-231 celic gojenih v prisotnosti fiziološke koncentracije glukoze in 2-DG že pri nizkih, mikromolarnih koncentracijah.
F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj
COBISS.SI-ID: 11194964Štetje celic je močno orodje za spremljanje številnih pojavov v biologiji in medicine, vendar pa je metoda časovno potratna, podvržena mnenju uporabnika in pogosto obravnavana kot neprijetno opravilo. Da bi pospešili proces štetja celic na slikah fluoresccenčnega mikroskopa smo v sodelovanju z dvema ekipama na Fakulteti za računalništvo in informatiko (UNI LJ) razvili dva programa za avtomatsko in polavtomatsko štetje celic: CellCounter in Learn123. Oba programa temeljita na istem setu algoritmov, vendar pa so parametri teh algoritmov pri CellCounter-ju močno optimizirani in predefinirani, medtem ko Learn123 s pomočjo genetskega algoritma parameter filtrov prilagaja vsakemu novemu setu učnih slik. CellCounte vsebuje tudi razširitev za štetje celic na prekrivajočih se slikah istega vidnega polja. Oba programa omogočata ponovljivo, zanesljivo, hitro in natančno detekcijo fluorescenčnih objektov in ju lahko uporabimo pri vrsti različnih bioloških in biotehnoloških poskusov, kjer se za vrednotenje specifičnih pojavov uporabljajo fluorescenčna barvila. Program s pridom uporabljamo tudi za analizo proliferacije celic.
F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin
COBISS.SI-ID: 11059028