Patološko spremenjeno delovanje presnovnih poti rakavih celic predstavlja tudi možnost tarčnega pristopa. V zadnji letih poteka vrsta kliničnih raziskavah različnih učinkovin -modulatorjev presnove, kot npr. inhibitor glikolize 2-deoksi glukoza (2-DG) za zaviranje Warburgovega efekta ali metformin, ki je eno izmed najbolj pogosto uporabljenih zdravil za zdravljenje diabetesa tipa 2. Ugotovili smo presentljiv pojav odplepljanja živih MDA-MB-231 celic raka. Trojno negativni rak dojke ima povečano stopnjo metastaziranja in posledično slabo prognozo. Da lahko metastazirajo, se morajo celice raka dojke odlepiti od glavne tumorske mase brez aktivacije programirane celične smrti, ki je posledica pomanjkanja komunikacije med celico in zunajceličnim matriksom (anoikis).. Celice MDA-MB-231, odporne na anoikis, smo hkrati izpostavili metforminu in 2-deoksi-D-glukozi (2-DG). Delež plavajočih celic se je ob izpostavitvi izrazito povečal (70%), od katerih je bilo 95% viabilnih, Po prenosu v medij brez farmakoloških učinkovin so celice ponovno proliferirale. Hkratna izpostavitev celic MDA-MB-231 metforminu in 2-DG je sprožila močno aktivacijo AMP-aktivirane proteinske kinaze (AMPK). Neposredna aktivatorja AMPK, A-769662 in AICAR, nista imela večjega učinka na delež plavajočih celic MDA-MB-231, kar pomeni da je aktivacija AMPK potreben vendar ne zadosten pogoj za odlepljanje rakavih celic. Naši rezultati kažejo, da je ločena analiza plavajočih in pritrjenih rakavih celic lahko ključnega pomena pri evalvaciji proti-rakavih učinkovin. Kot prvi smo opisali ta pojav, ki lahko igra pomembno vlogo pri procesu metastaziranja.
COBISS.SI-ID: 11739732
Nekatere farmako-epidemiološke raziskave so namreč pokazale, da metformin prepreči nastanek raka in podaljša preživetje pacientov z različnimi rakavimi oboljenji, med drugim tudi z rakom na dojkah. Delovanje metformina še ni popolnoma pojasnjeno. Eno od pomembnih vprašanj glede delovanja metformina na rakave celice je torej, ali metformin deluje neposredno na rakave celice že pri nizkih, mikromolarnih koncentracijah. Poleg posrednega učinka na rakave celice zaradi izboljšane homeostaze glukoze in inzulina v krvi, nekatere raziskave nakazujejo, da metformin deluje na rakave celice tudi neposredno. Metformin zavre delovanje kompleksa 1 v dihalni verigi kar povzroči energijski stres in aktivacijo z AMP-aktivirane proteinske kinaze (AMPK). Ugotovili smo, da visoke koncentracije metformina (5 mM) pri fiziološki koncentraciji glukoze v gojišču nimajo vpliva na celice MDA-MB-231 kar je v nasprotju z nekaterimi raziskavami. Medtem ko v odsotnosti glukoze metformin zavre proliferacijo MDA-MB-231 celic že pri cca. 300 µM koncentraciji. Nekonsistentnost med raziskavami smo pojasnili z upadanjem glukoze v gojišču pri daljšem gojenju celic brez menjave gojišča (3 dni). Nadalje smo pokazali tudi sinergistično delovanje 2-DG z metforminom že pri fiziološki 0.6mM koncentraciji 2DG. V celoti smo pokazali, da je ključno natančno kontroliranje nivoja glukoze, in da metformin nima antiproliferativnega učinka pri 1g/l glukoze.
COBISS.SI-ID: 11347540
Članek se osredotoča na analizo mehanizmov vnosa genov z metodo elektroporacije (gensko elektrotransfekcijo), ki se je v zadnjih letih izkazala za obetavno, od virusov neodvisno metodo vnosa plazmidne DNA; oligonukleotidov in kratkih RNA molekul. Predstavili smo nove eksperimentalne in teoretične rezultate analize različnih korakov v procesu elektrotransfekcije pritrjenih celic in celičnih suspenzij, podkrepljene s teoretično analizo relevantnih biofizikalnih procesov. V in vitro študiji smo se dotaknili odprtih vprašanj tega procesa: kako je elektropermeabilizacija povezana z učinkovitostjo elektrotransfekcije; kakšna je vloga elektroforeze DNA za kontakt in prenos čez membrano; vizualizirali in teoretično analizirali smo interakcije med DNA in membrano ter njihovo vlogo pri učinkovitosti transfekcije ter določili razlike med pritrjenimi in suspendiranimi celicami. Uporabili smo različne kombinacije visokonapetostnih in nizkonapetostnih pulzov. Pokazali smo, da je ključni korak vstavitev DNA v elektropermeabilizirano membrano, ki je pod vplivom elektroforetične sile. Vstavljena DNA se nato počasi prenese v citosol, od koder je le še vstop v jedro omejujoči dejavnik transfekcije. Kvantifikacija in teoretična analiza ključnih parametrov je pokazala, da število molekul DNA, ki interagirajo z elektropermeabilizirano membrano, narašča z naraščajočo koncentracijo DNA ali z dodatnimi elektroforetskimi nizkonapetostnimi pulzi poleg visokonapetostnih. Kljub temu transfekcija doseže zasičenje, kar namiguje da se lahko uspešno prenese le določeno število molekul DNA. Razlike med transfekcijo pritrjenih in suspendiranih celic razložimo z bolj homogeno velikostjo, obliko in gibanjem suspendiranih celic. Na podlagi predstavljenih rezultatov sklepamo, da se DNA najverjetneje prenese preko stabilnih elektropor ali preko elektro-stimulirane endocitoze, ki je odvisna od parametrov pulzov. Razumevanje razmerij med permeabilizacijo, elektroforezo, viabilnostjo in učinkovitostjo transfekcije lahko pomaga pri hitrejši optimizaciji protokolov električnih pulzov za specifične aplikacije. V kombinaciji z ustreznimi protirakavimi učinkovinami lahko izkoristimo elektroporacijo za ciljno izboljšanje učinkovitosti ali boljše razumevanje delovanja določene učinkovine. Objaveljno v reviji Scientific Reports NPG IF=4.2 http://www.nature.com/scientificreports
COBISS.SI-ID: 10952788
SLO Sladkorna bolezen predstavlja enega največjih zdravstvenih problemov v sodobni družbi. Odkrivanje novih oblik zdravljenja je zato prednostna naloga biomedicinskih raziskav. Ena izmed glavnih strategij pri oblikovanju novih pristopov k zdravljenju sladkorne bolezni je aktivacija encima z AMP-aktivirane protein-kinaze (AMPK), ki spremeni celične presnovne procese tako, da se poveča privzem glukoze v mišice, kar posledično zniža koncentracijo krvnega sladkorja. Ta pristop, ki je v načelu sicer zelo obetaven, pa je bilo do sedaj težko prenesti v prakso, ker 5-aminoimidazol-4-karboksamid 1-β-D-ribofuranozid (AICAR), ki je sicer učinkovit in tudi najpogosteje uporabljen aktivator AMPK, v krvi ne doseže koncentracije, ki bi zadoščala za aktivacijo AMPK v mišici. Nekateri drugi aktivatorji AMPK pa ne delujejo na mišične oblike AMPK. Glavni namen naše študije, v kateri smo uporabili biokemične in molekularno-biološke pristope, vključno z mišicami z izbitim genom za regulacijsko podenoto AMPK, je bil preveriti, ali zdravilo metotreksat, ki se sicer zelo pogosto uporablja za zdravljenje raka in revmatičnih bolezni, upočasni razgradnjo AICAR v mišici in zaradi tega učinka spodbudi aktivacijo AMPK. Ugotovili smo, da AICAR v koncentraciji, ki jo doseže pri človeku v krvi, ob sočasni uporabi metotreksata zadošča za močno aktivacijo AMPK v mišici. Pokazali smo tudi, da AICAR in metotreksat prek AMPK spodbudita ugodne presnovne prilagoditve, kot je povečan privzem glukoze v mišico. Dvotirna terapija z AICAR in metotreksatom bi zato lahko zaobšla trenutne omejitve pri uporabi AICAR za zniževanje krvnega sladkorja pri zdravljenju sladkorne bolezni. S to raziskavo smo torej z inovativnim pristopom k uporabi klinično uveljavljenega zdravila metotreksat odprli povsem novo pot za razvoj učinkovin za zdravljenje sladkorne bolezni. AMPK pa je hkrati tudi zelo zanimiva tarča za targetiranje spremenjenega metabolizma raka. Tako lahko znanje in metodologijo te študije uporabimo tudi za analizo vpliva različnih aktivatorjev AMPK na potencilano delovanje na rakave celice.
COBISS.SI-ID: 31657689
Uvod: Na prvi pogled izgleda, da je veliko podobnosti med primarnim metabolizmom kvasovk (Crabtree efekt) in metabolizmom humanih rakastih celic (Warburgov efekt). Pri obeh gre za pospešen metabolni pretok preko glikolize, ki vodi do izločanja etanola, oziroma laktata. Pri rakastih celicah so predlagali, da pospešen glikolitični pretok omogoča spremenjena kinetika 6-fosfofrukto-1-kinaze (Pfk), ki je glavni regulatorni encim glikolize. Posttranslacijska modifikacija omogoča nastanek kratkega, visoko aktivnega Pfk-M fragmenta, ki je rezistenten na inhibicijo povratne zveze in nastane po proteolitičnem odcepu C-terminalnega dela nativnega humanega Pfk-M. Po drugi strani pa pospešeno glikolizo pri kvasovki Saccharomyces cerevisiae sprožijo optimalni pogoji za rast. Rezultati: S ciljem, da bi ocenili deregulacijo glikolize pri kvasnih celicah, smo gen sfPFKM, ki kodira nastanek visoko aktivnega kratkega fragmenta vnesli v sev S. cerevisiae, ki je imel izbite lastne gene za Pfk encime. Vendar pa sev sfPFKM ni rasel na glukozi ali fruktozi. Glukoza je celo sprožila hitro deaktivacijo Pfk1 aktivnosti. Pfk1 aktivnost pa smo lahko zaznali med gojenjem te transformante na maltoznem gojišču, vendar pa je bila rast sfPFKM transformante mogoča le ob dodatku etanola v gojišče. Izgleda, da etanol omili zrušeno ravnotežje med NADH/NADPH v celicah, ki pa so rastle počasneje kot sev z nativnim humanim nPFKM. Šele v ozki ekološki niši z nizko koncentracijo maltoze in nekaterimi drugimi izboljšavami smo uspeli zaznati hitrejšo rast seva sfPFKM v primerjavi s sevom nPFKM. Ugotovili smo, da sev z modificiranim Pfk-M encimom pospešeno tvori fenilacetaldehid. Kar ni bil primer pri sevu z nativnim Pfk-M. Zaključek: Visoko aktiven kratek Pfk-M fragment, ki je značilen za rakaste celice pri kvasnih celicah sproži vrsto kontrolnih mehanizmov. To dokazuje, da imajo kvasne celice, kot so prostoživeči mikroorganizmi, bistveno bolj kompleksno regulacijo primarnega metabolizma v primerjavi z rakastimi celicami, ki se razvijajo v večceličnem organizmu. Vendar pa bi pri kvasovkah zelo verjetno lahko dosegli povečano produktivnost, če bi z genskim inženiringom odstranili nekatere kontrolne mehanizme.
COBISS.SI-ID: 6147098