Sladkorna bolezen predstavlja enega največjih zdravstvenih problemov v sodobni družbi. Odkrivanje novih oblik zdravljenja je zato prednostna naloga biomedicinskih raziskav. Ena izmed glavnih strategij pri oblikovanju novih pristopov k zdravljenju sladkorne bolezni je aktivacija encima z AMP-aktivirane protein-kinaze (AMPK), ki spremeni celične presnovne procese tako, da se poveča privzem glukoze v mišice, kar posledično zniža koncentracijo krvnega sladkorja. Ta pristop, ki je v načelu sicer zelo obetaven, pa je bilo do sedaj težko prenesti v prakso, ker 5-aminoimidazol-4-karboksamid 1-β-D-ribofuranozid (AICAR), ki je sicer učinkovit in tudi najpogosteje uporabljen aktivator AMPK, v krvi ne doseže koncentracije, ki bi zadoščala za aktivacijo AMPK v mišici. Nekateri drugi aktivatorji AMPK pa ne delujejo na mišične oblike AMPK. Glavni namen naše študije, v kateri smo uporabili biokemične in molekularno-biološke pristope, vključno z mišicami z izbitim genom za regulacijsko podenoto AMPK, je bil preveriti, ali zdravilo metotreksat, ki se sicer zelo pogosto uporablja za zdravljenje raka in revmatičnih bolezni, upočasni razgradnjo AICAR v mišici in zaradi tega učinka spodbudi aktivacijo AMPK. Ugotovili smo, da AICAR v koncentraciji, ki jo doseže pri človeku v krvi, ob sočasni uporabi metotreksata zadošča za močno aktivacijo AMPK v mišici. Pokazali smo tudi, da AICAR in metotreksat prek AMPK spodbudita ugodne presnovne prilagoditve, kot je povečan privzem glukoze v mišico. Dvotirna terapija z AICAR in metotreksatom bi zato lahko zaobšla trenutne omejitve pri uporabi AICAR za zniževanje krvnega sladkorja pri zdravljenju sladkorne bolezni. S to raziskavo smo torej z inovativnim pristopom k uporabi klinično uveljavljenega zdravila metotreksat odprli povsem novo pot za razvoj učinkovin za zdravljenje sladkorne bolezni. AMPK pa je hkrati tudi zelo zanimiva tarča za targetiranje spremenjenega metabolizma raka. Tako lahko znanje in metodologijo te študije uporabimo tudi za analizo vpliva različnih aktivatorjev AMPK na potencilano delovanje na rakave celice.
COBISS.SI-ID: 31657689
V sodelovanju z Inštitutom za patofiziologijo (Medicinska fakulteta UL) smo razvili protokole za vnos kratkoverižnih RNA in analizirali mehanizme njihovega vnosa v primarne mišične mioblaste – specifično smo se osredotočili na utišanje gena za HIF (''hypoksia inducible factor''), ki je ključni regulator celične homeostaze pri hipoksiji in ter zato igra tudi pomembno vlogo pri raku. Novi pristopi temeljijo tudi na zaviranju aktivacije HIF alpha. Optimizirali smo elektroporacijski medij in določili parametre električnih pulzov, s katerimi smo dosegli 80% utišanje mRNA za HIF-1α. Vzporedno smo izvedli tudi študijo viabilnosti celic po elektroporaciji za iste parametre. Utišanje smo spremljali z metodama qPCR in Western blot, kjer smo opazovali učinek na tarčno mRNA ter na sam protein HIF-1α. Zaradi pomena samega HIF-1α za različne mišične patologije smo preverili tudi učinek na ''down-stream'' gene za PGK (phosphoglycerate kinase) in VEGF (vascular endothelial growth factor). Pripravljamo prvo objavo v mednarodno revijo. Sam protokol vnosa, ki smo ga razvili pa nam bo omogočal vnos različnih kratkoverižnih RNA (siRNA, mRNA, shRNA...), kar je zanimivo tako za raziskave mehanizmov vnosa genskega materiala v celice kot tudi za terapevtske namene. HIF, VEGF (vključen v angiogenezo) in PGK so tudi ključni za celični metabolizem ter tako predstavljajo potencialno tarčo pri zdravljenju raka.
COBISS.SI-ID: 11125588
Članek se osredotoča na analizo mehanizmov vnosa genov z metodo elektroporacije (gensko elektrotransfekcijo), ki se je v zadnjih letih izkazala za obetavno, od virusov neodvisno metodo vnosa plazmidne DNA; oligonukleotidov in kratkih RNA molekul. Predstavili smo nove eksperimentalne in teoretične rezultate analize različnih korakov v procesu elektrotransfekcije pritrjenih celic in celičnih suspenzij, podkrepljene s teoretično analizo relevantnih biofizikalnih procesov. V in vitro študiji smo se dotaknili odprtih vprašanj tega procesa: kako je elektropermeabilizacija povezana z učinkovitostjo elektrotransfekcije; kakšna je vloga elektroforeze DNA za kontakt in prenos čez membrano; vizualizirali in teoretično analizirali smo interakcije med DNA in membrano ter njihovo vlogo pri učinkovitosti transfekcije ter določili razlike med pritrjenimi in suspendiranimi celicami. Uporabili smo različne kombinacije visokonapetostnih in nizkonapetostnih pulzov. Pokazali smo, da je ključni korak vstavitev DNA v elektropermeabilizirano membrano, ki je pod vplivom elektroforetične sile. Vstavljena DNA se nato počasi prenese v citosol, od koder je le še vstop v jedro omejujoči dejavnik transfekcije. Kvantifikacija in teoretična analiza ključnih parametrov je pokazala, da število molekul DNA, ki interagirajo z elektropermeabilizirano membrano, narašča z naraščajočo koncentracijo DNA ali z dodatnimi elektroforetskimi nizkonapetostnimi pulzi poleg visokonapetostnih. Kljub temu transfekcija doseže zasičenje, kar namiguje da se lahko uspešno prenese le določeno število molekul DNA. Razlike med transfekcijo pritrjenih in suspendiranih celic razložimo z bolj homogeno velikostjo, obliko in gibanjem suspendiranih celic. Na podlagi predstavljenih rezultatov sklepamo, da se DNA najverjetneje prenese preko stabilnih elektropor ali preko elektro-stimulirane endocitoze, ki je odvisna od parametrov pulzov. Razumevanje razmerij med permeabilizacijo, elektroforezo, viabilnostjo in učinkovitostjo transfekcije lahko pomaga pri hitrejši optimizaciji protokolov električnih pulzov za specifične aplikacije. V kombinaciji z ureznimi protirakavimi učinkovinami lahko izkoristimo elektroporacijo za ciljno izboljšanje učinkovitosti ali boljše razumevanje delovanja določene učinkovine. Published in Scientific Reports NPG: A'', IF=5.08 http://www.nature.com/scientificreports
COBISS.SI-ID: 10952788