Komponente intrinzične poti strjevanja krvi, med njimi FVIIIa, so primerne terapevtske tarče za zdravljenje venske tromboembolije, patološkega procesa na katerem temeljita dve zelo resni srčno-žilni bolezni, venska tromboza in pljučna embolija. V tem delu smo opisali unikaten glikoprotein iz strupa modrasa, VaaSPH-1, ki strukturno sodi med serinske proteaze, ne izraža pa encimske aktivnosti. Na človeško kri VaaSPH-1 deluje močno antikoagulantivno. Pokazali smo, da je ena od njegovih tarč FVIIIa, komponenta intrinsičnega tenaznega kompleksa v sistemu koagulacije krvi, z vezavo na katerega, prepreči vezavo FIXa. Antikoagulante s tako lastnostjo se pospešeno išče, saj bi bili precej bolj varna za medicinsko uporabo kot aktualna zdravila, ki pogosto izzovejo prekomerno krvavitev in druge zaplete. VaaSPH-1 predstavlja zelo obetaven molekularni model za načrtovanje nizko- molekularnih inhibitorjev z delovanjem na FVIIIa, na osnovi strukturnih lastnosti stične površine med VaaSPH-1 in FVIIIa. S tem namenom smo v študiji pripravili tri-dimenzionalni model kompleksa med VaaSPH-1 in FVIIIa ter predlagali najprimernejše strukturne elemente VaaSPH-1 za pripravo malih FVIIIa-vezavnih molekul, potencialne nove generacije antikoagulantov.
COBISS.SI-ID: 31735847
ß-nevrotoksične sekretorne fosfolipaze A2 (sPLA2) zastrupijo živčni končič tako, da blokirajo nevro-muskularno komunikacijo. Škoda, ki jo povzročijo te vrste sPLA2 (ß-ntx) nevronskim mitohondrijem je karakteristična in zelo podobna tisti, ki jo izzove strukturno sorodna endogena sPLA2 iz skupine IIA (GIIA) ob povišani aktivnost, na primer v zgodnji fazi Alzheimerjeve bolezni. Z uporabo amoditoksina (Atx), ß-ntx is strupa modrasa (Vipera a. ammodytes), smo detektirali receptor za sPLA2 (R25) v nevronskih mitohondrijih. V tem delu opisujemo njegovo izolacijo iz mitohondrijev z pomočjo kromatografskega postopka, ki temelji na afiniteti do Atx in njegovo strukturno karakterizacijo. Ugotovili smo, da je R25 podenota II citokrom c oksidaze (CCOX), ključnega elementa kompleksa dihalne verige. Da je CCOX res prvi znotrajcelični membranski receptor za sPLA2, smo potrdili z alternativnimi metodami Atx-afinitetnega označevanja očiščene CCOX in z demonstracijo, da se signala za Atx in CCOX v celicah PC12 v veliki meri prekrivata. To odkritje ponuja razlago mehanizma po katerem ß-ntx ovirajo sintezo ATP v zastrupljenem živčnem končiču. Poleg tega je odkritje odstira tudi nov vpogled v potencialno funkcijo in disfunkcijo endogene GIIA sPLA2 v mitohondriju.
COBISS.SI-ID: 32050215
Dostava v pljuča s pomočjo nanodelcev je v nanomedicini pristop, ki veliko obeta. Za učinkovito in varno uporabo nanodelcev za vdihavanje pa je razumevanje njihove interakcije z mehanizmom tvorbe pljučnega surfaktanta ključnega pomena. Naši poskusi na človeških celicah pljučnega raka A549, modelu alveolarnih celic tipa II, so pokazali, da že ne-citotoksične koncentracije s siliko-oblečenih superparamagnetnih nanodelcev železovega oksida (SiO2-SPIONi) prizadenejo metabolizem surfaktanta in biogenezo lamelarnih telesc (LB), in posledično motene zmožnosti reduciranja hipofaze površinske napetosti. Da bi zagotovili varno uporabo nanodelcev za dostavo v pljuča, je torej potrebno upoštevati potencialno interferenco nanodelcev z biogenezo LB.
COBISS.SI-ID: 30433319
Protein RecA igra osrednjo vlogo pri odzivu bakterij na poškodbo DNA. Med drugim stimulira avtoinaktivacijo zaviralca transkripcije LexA. Na ta način RecA prispeva k razvoju rezistence bakterij na antibiotike. Originalni pristop za zmanjšanje sposobnosti bakterij, da pridobijo odpornost na antibiotike, bi zato bil, da se blokira nastanek kompleksa med RecA in LexA. Da omogočimo racionalno načrtovanje inhibitorjev za tvorbo kompleksa LexA–RecA, smo v tem delu določili interakcijsko površino med LexA in aktivno obliko RecA (RecA*), to je filamentom RecA–ssDNA (enoverižna DNA), in na tej osnovi ustvarili tridimenzionalni model kompleksa. Model je razkril, da se ena podenota dimera LexA kot klin vrine v globoko vdolbino, ki spiralno poteka vzdolž filamenta RecA*. Pri tem se tvori več interakcijskih mest vzdolž sedmih zaporednih enot RecA vezanih na ssDNA. Na osnovi modela smo predlagali, da LexA tudi v svoji DNA–vezavni obliki lahko tvori kompleks z RecA* in, da peratorska DNA sterično prepreči interakcijo med LexA in RecA*, ki sicer sproži izražanje genov SOS. Model tudi pokaže, da poleg katalitične, C-terminalne domene, z RecA* interagira tudi N-terminalna, DNA–vezavna domena LexA. Ker smo vse na modelu osnovane napovedi potrdili tudi eksperimentalno, predstavlja objavljeni model zanesljiv vpogled v odločilni korak bakterijskega odziva na poškodbe DNA.
COBISS.SI-ID: 26953767
Že nekaj desetletij poznamo peptide iz strupov polžev stožcev, t.i. konopeptide, ki izražajo celo paleto farmakoloških aktivnosti. Malo pozornosti pa je bilo namenjene proteinom z večjo molekulsko maso (HMM) iz strupov mehkužcev. Da bi bolje osvetlili te proteine, smo se v tej študiji posvetili poglobljeni karakterizaciji teh molekul v strupu piscivornega polža Conus consors, in sicer v strupu iz strupne žleze (nezrel strup) in tistemu, ki ga polž injicira v žrtev (zrel strup). HMM smo ločili s pomočjo dvodimenzionalne elektroforeze in posamezne komponente analizirali z masno spektroskopijo (MS). MS rezultate smo interpretirali z analizo po sekvenčni bazi UniProt, C. consors EST knjižnicah strupnega izvodila in žleze slinavke ter genomskih sekvenc. V lumnu izvodila strupa smo identificirali številne proteinske družine, jim pripisali biološko funkcijo in predlagali njihovo vlogo v procesu tvorbe in zorenja strupa. Zanimivo je, da smo odkrili tudi proteine, ki ne spadajo v nobeno od že opisanih družin, tako da je njihova funkcija za enkrat še neznana. Le dve skupini HMM sta prešli selekcijski proces in se znašli tudi v injiciranem strupu. To so ehotoksini in hialuronidaze. To nakazuje tudi njun prispevek v procesu zastrupitve. Naša analiza pomeni velik korak naprej pri opisu nabora proteinov, ki jih uporablja polž stožec pri sintezi strupa, njegovem zorenju in delovanju.
COBISS.SI-ID: 26042407
EpCAM (epitelijska celicˇna adhezijska molekula; modularen transmembranski glikoprotein) je zˇe nekaj desetletij znana kot zelo pomemben tumorski oznacˇevalec, v zadnjem cˇasu pa je bilo osnovanih precej terapevtskih pristopov, ki temeljijo na EpCAM kot oznacˇevalcu za ciljano dostavo zdravilnih ucˇinkovin v blizˇino tumorja, a njihova uspesˇnost je bila precej nizka, tudi zaradi nepoznavanja strukture in funkcije EpCAM. V cˇlanku smo kot prvi na svetu opisali kristalno strukturo zunajcelicˇnega dela EpCAM, resˇeno v nasˇi skupini, pokazali, da molekula na celicˇni povrsˇini tvori dimer, s pomocˇjo molekulske dinamike preucˇili dimerizacijo transmembranskega dela, ter predstavili model medcelicˇne tetramerne enote. Rezultati so odlicˇna osnova za izboljsˇanje obstojecˇih in nacˇrtovanje novih terapevtskih pristopov.
COBISS.SI-ID: 1764911
Virusi, ki okužujejo bakterije (fagi) so prevladujoče biološke entitete na Zemlji in imajo izjemen vpliv na sestavo združb in evolucijo bakterij. Fagi so razvili raznolike in prefinjene molekularne mehanizme s katerimi si prilagodijo procese v bakteriji, da te sintetizirajo nove viruse, ki se sprostijo ob lizi gostiteljske bakterije. Pojasnili smo dosedaj še neopisano genetsko stikalo, s katerim fag GIL01 bakterije Bacillus thuringiensis preklopi iz spečega, dormantnega cikla v sprožitev sinteze novih virusov. V raziskavi dokažemo, da proces uravnavata dva majhna proteina faga. Prvi, gp7, uravnava delovanje transkripcijskega represorja LexA bakterije da vzpostavi dormantni cikel. Drugi, gp6, pa deluje kot genetsko stikalo, ki omogoči fagu, da spremeni svoj življenski slog in sproži nastanek novih virusov, ki zapustijo gostitelja. Presenetljivo, naši izsledki kažejo, da se je protein gp6 razvil iz proteina LexA gostitelja. To je redek primer dveh sorodnih proteinov, ki nadzirata genetsko stikalo, ob tem ko eden utiša in drugi aktivira prepis genov. Rezultati raziskave omogočajo razvoj novih protimikobnih učinkovin na podlagi malih fagnih proteinov, s katerimi bi, podobno kot GIL01, nadzirali procese v izbranem patogenu.
COBISS.SI-ID: 4764239
Za pojasnitev izvora in evolucije multigenskih družin udomačenih genov, nastalih iz retroelementov Metaviridae smo uporabili filogenomsko analizo 90 različnih genomov strunarjev in široko taksonomsko vzorčenje. Dokazali smo, da je večina udomačenih genov nastala v predniku placentalnih sesalcev. S filogenomsko analizo udomačenih genov in njihovih izvornih retroelementov smo dokazali, da so udomačeni geni nastali kot posledica več neodvisnih dogodkov molekularne udomačitve, nastale genske družine pa so se povečevale z genskimi duplikacijami. Dokazali smo, da so tako udomačeni geni kot njihove kromosomske lokacije močno ohranjeni znotraj placentalnih sesalcev, kar nakazuje na močno adaptivno evolucijo in hitro fiksacijo teh genov v predniku placentalnih sesalcev. Dokazali smo, da so udomačeni geni nastali iz ostankov nekoč aktivnih retroelementov, ter da so svoje regulatorne in promotorske regije pridobili na novo. Pridobitev in evolucija regulatornih zaporedij udomačenih genov sta igrali pomembno vlogo pri adaptivni evoluciji teh genov ter sta pomembni za pojasnitev tkivno, vrstno in časovno specifičnih vzorcev izražanja teh genov.
COBISS.SI-ID: 26492711
V tem prebojnem članku opisujemo sposobnost lipidnih kapljic, da podaljšajo preživejte celic raka dojke in razkrivamo povsem novo, »metabolično« vlogo sekretornih fosfolipaz A2 (sPLA2) pri raku. V predhodnih študijah so bili opisani različni in pogosto nasprotni učinki sPLA2 na rakave celice. Prav tako so bili neuspešni poskusi, da bi opisali njihovo vlogo z aktivacijo signalnih poti in nastanek lipidnih mediatorjev iz arahidonske kisline (AK). Lastnost sPLA2, da poleg AK sprošča še druge maščobne kisline, ni bila nikoli osrednja tema raziskav, prav tako njene aktivnosti niso nikoli povezali z lipidnimi kapljicami ali energijskim metabolizmom. V članku smo pokazali, da maščobne kisline, ki jih sPLA2 sprošča iz celičnih membran celic raka dojke inducirajo biogenezo lipidnih kapljic in omogočajo celicam preživetje v stresnih pogojih. Članek jasno povezuje glavne člene mehanizma in opisuje bistvene spremembe lipidnega metabolizma, ki omogočajo rakavim celicam preživetje, med drugim aktivacijo oksidacije maščobnih kislin v mitohondrijih, zavrtje de novo lipogeneze in aktivacijo z AMP-aktivirane protein kinaze (AMPK). Sposobnost s sPLA2-induciranih lipidnih kapljic, da zaščitijo rakave celice pred stresom, smo povezali z razgradnjo lipidnih kapljic in jo zavrli z inhibitorji oksidacije maščobnih kislin. Lipoliza in mitohondrijska oksidacija sta torej ključna člena pri obrambi celic raka dojke pred stresom.
COBISS.SI-ID: 27087655
Pred kratkim je bilo pokazano, da se egerolizini OlyA, PlyA2 in erilizin A (EryA) iz rodu Pleurotus preferenčno povezujejo z umetnimi lipidnimi membranami, ki vsebujejo 50 molskih % ceramid fosfoetanolamina (CPE), glavnega sfingolipida v membranah nevretenčarjev. V članku smo dokazali sposobnost egerolizinov OlyA6, PlyA2 in EryA, da se vežejo na celične membrane žuželk in na umetne lipidne membrane, ki v svoji sestavi imajo fiziološko relevantne koncentracije CPE. Dokazali smo tudi sposobnost omenjenih egerolizinov, da v kombinaciji s PlyB permeabilizirajo omenjene membrane. Kompleksi teh egerolizinov s PlyB so pokazali selektivno toksičnost proti ličinkam in odraslim osebkom koruznega hrošča, ter proti ličinkam koloradskega hrošča. Rezultati močno nakazujejo na dejstvo, da citolitični kompleksi egerolizin/PlyB prepoznavajo CPE kot receptorsko molekulo v črevesu žuželk. Ta način vezave je drugačen od opisanih mehanizmov delovanja insekticidnih kompleksov bakterijskega izvora na osnovi egerolizinov, ali od mehanizma delovanja Cry toksinov bakterije Bacillus thuringiensis, ki imajo proteinske receptorje. Specifična interakcija s CPE in tvorba transmembranskih por v kombinaciji s PlyB nakazujejo na možnost uporabe kompleksov egerolizin/PlyB kot novih biopestidicov za kontrolo koruznega in koloradskega hrošča.
COBISS.SI-ID: 5013839