Vozli so izjemne naravne topološke oblike. Samosestavljanje vozlanih polimerov brez prekinitve ali tvorbe kovalentne vezi je zahtevna, saj je treba verigo ovijati skozi že predhodno oblikovane zanke v točno določenem vrstnem redu. Opisali smo načela za usmerjeno zvijanje visoko vozlanih nanostruktur enojne verige DNK ter jih pokazali tudi pri tvorbi kvadratne piramide nano velikosti. Zvijanje vozlov je določeno z razporeditvijo modulov v enoverižni DNK, ki tvorijo pare dvojne vijačnice, katerih razlike v stabilnosti so utemeljene na topoloških in kinetičnih pravilih. Med modeli enoverižne DNK, sestavljenih iz istih modulov in kodirajoč isto topologijo, se samo tisti z potjo sestavljanja upoštevajoč pravilo prostih koncev učinkovito zloži v načrtovano strukturo. Opisana strategija se lahko uporabili za načrtovanje sestavljanja drugih vozlanih načrtovanih polimerov, kot so RNA in proteini.
COBISS.SI-ID: 5880858
TALE- in CRISPR/Cas9-osnovane načrtovane vezavne domene predstavljajo velik tehnološki preboj v urejanju genoma, kot tudi v načrtovanju novih gentskih vezij. Obe platformi sta zmožni prepoznati redke in težko dostopne DNA segmente. TALE in dCas9 vezavne domene vezane na transkripcijske regulatorne domene smo uporabili za izgradnjo inženirsko načrtovanih logičnih vezij ter medsebojno primerjali prednosti in slabosti obeh platform pri delovanju funkcionalno delujočega NOR vezja v sesalskih celicah. Obe platformi sta izkazovali dobro ortogonalnost pri prepoznavanju istih DNA sekvenc. Čeprav je sistem CRISPR/dCas9 lažji za načrtovanje in izgradnjo, pa je vezava TALE aktivatorjev močnejša, prav tako je TALE platforma zanesljivejša pri izvedbi vezij z več ravnmi regulacije
COBISS.SI-ID: 5948442
Razvoj ortogonalnih, načrtovanih in prilagodljivih transkripcijskih regulatorjev je pomemben cilj sintezne biologije. Njihovo delovanje je klasično nadzorovano zinducibilno oligomerizacijo ali interakcijo med DNK vezavno in aktivacijsko/represijsko domeno. Raziskali smo možnost načrtovanja DNK vezavne domene transcripcijskemu aktivatorju podobnega efektorja (ang. TALE), ki se ovije okrog verige DNK in ob intramolekularni ciklizaciji topološko preprečili vezavo na DNK. Regulacijo smo nadzoovali bodisi z nekovalentno od liganda odvisno ciklizacijo bodisi s kovalentno ciklizacijo molekul inteina oz. z njihovo proteolitično cepitvijo. Pokazali smo, da okrog verige DNK oviti TALE regulatorji dejansko inhibirajo vezavo na DNK, ki pa se v celoti povrne ob odstranitvi vezanega cikliziranega TALE z uporabo rapamicina oz. s proteolitično cepitvijo. Poleg tega smo pokazali reverzibilnost, aktivacijo genomskih tarč in izvedli logična vrata na osnovi kombinacije cikliziranih proteinov, proteolitične cepitve in od liganda odvisne dimerizacije.
COBISS.SI-ID: 5839898
Mieloidni diferenciacijski faktor 2 (MD-2) je zunajcelični protein, povezan z ektodomeno receptroja TLR4, ki igra ključno vlogo pri prepoznavanju bakterijskega LPS. Kljub veliki strukturni in funkcijski podobnosti med človeškim (h) in mišjim (m) MD-2, pa so med njima tudi medvrstne razlike. Človeški MD-2 je sposoben vezati LPS v odsotnosti TLR4, nasprotno se mišji MD-2 odziva na prisotnost LPS le, če sta mMD-2 in mTLR4 hkrati izražena v isti celici. Predhodno je bilo pokazano, da so razlike povezane z aminokislinskimi ostanki na robu LPS vezavnega žepa. V tej študiji smo se usmerili v preučevanje vpliva hidrofobnih aminokislinskih ostankov v vezavnem žepu MD-2 kot vira funkcionalnih razlik med človeškim in mišjim MD-2. Odločilno vlogo pri vezavi LPS v vezavnem žepu človeškega MD-2 ima Val135. Mutanta človeškega MD-2 s spremenjenim Val135 v Ala izgubi sposobnost samostojne vezave LPS in pridobi karakteristike podobne mišjemu fenotipu. Empirične rezultate smo podprli tudi s simulacijo molekulske dinamike. Sklepamo, da ostanek na položaju 135 proteina MD-2 nadzira dinamiko vezavnega žepa in njeno sposobnost sprejema lipida A.
COBISS.SI-ID: 5867034
Oksidativni stres v odgovor na okužbo ali sterilno poškodbo aktivira prirojeni imunski odziv. Ugotovili smo, da ekstracelularni vezikli (EV), izolirani iz plazme bolnikov z revmatoidnim artritisom ali izločani iz celic izpostavljenih oksidativnemu stresu vsebujejo oksidirane fosfolipide, da stimulirajo celice, ki izražajo Tollu podoben receptor 4 (TLR4), v odvisnosti od koreceptorja MD-2. EV iz zdravih oseb ali rekonstruirani sintetični EV izpostavljeni omejeni oksidaciji so pridobili lastnost spodbujanja celic, ki izražajo TLR4, medtem ko podaljšana oksidacija zmanjša to aktivnost. Poleg tega smo ugotovili, da 15-lipoksigenaza tvori hidro(pero)ksilirane fosfolipide, ki stimulirajo celice, ki izražajo TLR4. Molekularno modeliranje kaže, da je mehanizem aktivacije TLR4 z oksidiranimi fosfolipidi iz EV strukturno podoben tistemu na osnovi liganda TLR4 lipopolisaharida (LPS). To je bilo podprto z eksperimenti, ki kažejo, da EV posredovana stimulacija celic potrebuje MD-2, da mutacije, ki zavirajo vezavo LPS na TLR4 zmanjšajo stimulacijski učinek EV in da EV povzroča TLR4 dimerizacijo. Po drugi strani pa je analiza genske ekspresije profilov pokazala večji delež odziva genov, ki kodirajo faktorje, ki zmanjšujejo vnetje kot odziv na LPS. Skupaj ti podatki kažejo, da EV preko oksidativnega stresa deluje kot signal nevarnosti, kar je osnova za pomembno vlogo, ki jo igra TLR4 pri vnetnih boleznih.
COBISS.SI-ID: 5706266