Oksidativni stres v odgovor na okužbo ali sterilno poškodbo aktivira prirojeni imunski odziv. Ugotovili smo, da ekstracelularni vezikli (EV), izolirani iz plazme bolnikov z revmatoidnim artritisom ali izločani iz celic izpostavljenih oksidativnemu stresu vsebujejo oksidirane fosfolipide da stimulirajo celice, ki izražajo Tollu podoben receptor 4 (TLR4), v odvisnosti od koreceptorja MD -2. EV iz zdravih oseb ali rekonstruirani sintetični EV izpostavljeni omejeni oksidaciji so pridobili lastnost spodbujanja celic, ki izražajo TLR4, medtem ko podaljšana oksidacija zmanjša to aktivnost. Poleg tega smo ugotovili, da 15-lipoksigenaza tvori hidro(pero)ksilirane fosfolipide, ki stimulirajo celice, ki izražajo TLR4. Molekularno modeliranje kaže, da je mehanizem aktivacije TLR4 z oksidiranimi fosfolipidi iz EV strukturno podoben tistemu na osnovi liganda TLR4 lipopolisaharida (LPS). To je bilo podprto z eksperimenti, ki kažejo, da EV posredovana stimulacijo celic potrebuje MD-2, da mutacije, ki zavirajo vezavo LPS na TLR4 zmanjšajo stimulacijski učinek EV in da EV povzroča TLR4 dimerizacijo. Po drugi strani pa je analiza genske ekspresije profilov pokazala večji delež odziva genov, ki kodirajo faktorje, ki zmanjšujejo vnetje kot odziv na LPS. Skupaj kažejo ti podatki, da EV deluje kot signal nevarnosti preko oksidativnega stresa, kar je osnova za pomembno vlogo, ki jo igra TLR4 pri vnetnih boleznih.
COBISS.SI-ID: 5706266
Sintetični oligodeoksiribonukleotidi (ODN), ki vsebujejo CpG (nemetiliran deoksicitidilil-deoksigvanozin dinukleotid) motiv aktivirajo endosomalni TLR9. Nukleotidna sekvenca, dolžina sekvence in dimerizacijske lastnosti ODN vplivajo na njihovo zmožnost aktivacije TLR9. Izvedli smo sistematično preiskavo motivov zaporedja fosfodiesterskih ODN razreda B in C, s ciljem opredeliti lastnosti zaporedja, ki vplivajo na aktiviranje TLR9. ODN, krajši od 21 nukleotidov in z adenozinom, ki je sledil citidin-gvanozinskemu (CG) dinukleotidnemu motivu, je imel znatno nižjo nagnjenost aktiviranja TLR9. Razdalja med stimulatornimi CpG motivi v ODN usklajuje aktivacijo celic B. Minimalna velikost ODN, ki aktivirajo človeški TLR9, obsegajo 2 CG dinukleotida ločena z 6-10 nukleotidi, kjer je pred prvim CpG motivom 5'-timidin ter podaljšani poli-timidin rep sledi na koncu 3' koncu ODN. Minimalno zaporedje omogoča vpogled v molekularni mehanizem prepoznavanja TLR9 liganda. Na osnovi zahtev zaporedja smo ugotovili, da nastaneta dve vezavni območji z različnima afinitetama za CG v človeškem TLR9 dimeru z zelo strogimim vezavnim mestom v stiku s 5' CpG motivom.
COBISS.SI-ID: 37867781
Sintetični oligodeoksiribonukleotidi (ODN), ki vsebujejo nemetiliran CpG posnemajo aktivacijo TLR9 s mikrobno DNK. ODN so močni spodbujevalci imunskega odziva v celicah, ki izražajo TLR9. Kljub široki uporabi miši kot poskusnih živali v temeljnih in aplikativnih imunoloških raziskavah, ključni elementi zaporedja, ki ureja aktiviranje mišjega TLR9 z ODN še niso dobro opredeljeni. Izvedli smo sistematično preiskavo motiva zaporedja fosfodiesterske ODN razreda B, namenom opredeliti lastnosti zaporedja, ki določajo aktivacijo mišjega TLR9. V nasprotju z ODN, ki aktivira človeški TLR9, kjer minimalno zaporedje za aktivacijo receptorja potrebuje par zaporedno sledečih CpG, smo ugotovili, je za aktivacijo mišjega TLR9 potreben en CpG motiv, postavljenih 4-6 nukleotidov od 5'-konca. Aktivacija je povečana s 5'TCC sekvenco v razdalji enega do treh nukleotidov od CG. CG dinukleotid v razdalji štirih do šestih nukleotidov od 5'-konca in dolžina ODN usklajujeta aktiviranje mišjih makrofagov. Dolžina ODN (23 in )29 nukleotidov zmanjšuje aktivacijo dendritičnih celic. ODN z minimalno sekvenco inducira citokinsko sintezo tipa Th1 v dendritičnih celicah in potrdi izražanje celičnih površinskih označevalcev v celicah B. Identifikacija minimalnega zaporedja omogoča vpogled v selektivnost zaporedja mišjega TLR9 in kaže na razlike v selektivnosti receptorjev med vrstami, kar je verjetno posledica razlik med vezavnimi mesti receptorjev.
COBISS.SI-ID: 5796378
TLR4 je eden najpomembnejših receptorjev naravne imunosti, ki poepoznava bakterijski LPS. vendar je bila dokazana vloga tega receptorja v številnih boleznih kjer ni infekcije z Gram-negativnimi bakterijami. V člankih so predlagali več kot 15 različnih naravnih agonistov TLR4 vendar je v veliko primerih aktivacija posledica kontaminacije z LPS, zato smo predlagali 3 postulate s katerimi bi dokazali obstoj dejanskega novga agonista TLR4. Ti postulate vključujejo: i) zahteva po prisotnosti TLR4 in MD-2, ii) sintetični ali in situ pripravljen agonist aktivira, za razliko od heterogene zmesi ali pridobljene z izolacijo kot so npr. rekombinantni protein ter iii) obstoj posebnih interakcij med agonistom ter TLR4 ali MD-2 ki so drugačne od aktivacije z LPS kar lahko dokažemo s 3D strukturo ali z lastnostmi točkovnih mutant.
COBISS.SI-ID: 5617434
We presented the new type of protein folds, topofolds, that are defined by the topological arrangement of the polypeptide chain along the edges of the polyhedral in contrast to the folds of natural proteins, which are defined by the hydrophobic core.
COBISS.SI-ID: 37569029