Zunajcelični mešički (angl. extracellular vesicles, EV) še vedno predstavljajo področje mnogih odprtih vprašanj. Uveljavljene analitske metode za njihovo preučevanje so pogosto vezane na specifične označevalce, kar viša ceno preiskav in preprečuje splošen pregled nad temi biološkimi strukturami. Pomembna fizikalna lastnost EV je njihova velikost. Tehniki statičnega in dinamičnega sipanja svetlobe, ki se uporabljata za določanje radija sukanja, Rg, in hidrodinamskega radija, Rh, sta do vzorca nedestruktivni, imata široko dinamično območje in sta nespecifični. Zanimalo nas je, ali in kako zanesljivo lahko z njima analiziramo populacije zunajceličnih mešičkov v kompleksnem vzorcu krvne plazme in kateri so kritični koraki za pridobitev pravilnih rezultatov. Izsledke smo pri več vzorcih primerjali z rezultati drugih metod – mikroskopije na atomsko silo, frakcioniranja v asimetričnem pretoku, pretočne citometrije in metode sledenja nanodelcem. Analizirali smo eksosomski standard, krvno plazmo štirih zdravih preiskovancev in izolate EV iz nje ter vzorce plazme osemnajstih bolnikov, odvzete pred in po operativnem posegu z zunajtelesnim krvnim obtokom. V vzorcih krvne plazme smo zasledili podoben profil delcev, ki bi lahko ustrezali EV in smo jih detektirali tudi v vzorcih mnogo bolj razredčenih “izolatov” in eksosomskega standarda. Pri tem je bil prisoten značilen premik pripisanih srednjih Rh k večjim vrednostim, ki bi lahko izviral iz napačno predpostavljenega parametra viskoznosti. Da bi opredelili, katere komponente pri obravnavi EV v krvni plazmi predstavljajo medij in mu določili ustrezno viskoznost, smo pripravili več eksperimentov. Zaključili smo, da je za vzorce krvne plazme pri temperaturi 25 °C vrednost 1,2 mPas, ki ustreza viskoznosti raztopine proteinov, podobne krvni plazmi, precej (oz. dovolj) dober približek. Verjamemo, da uporaba te vrednosti vodi do pravilnejše ocene Rh za EV v primerjavi s tisto, ki jo dobimo z upoštevanjem viskoznosti vode (0,89 mPas pri 25 °C). Populacije eksosomov z uporabo He-Ne laserja zaradi njihove majhnosti in delnega prekrivanja s frakcijo proteinov nismo mogli zanesljivo okarakterizirati. Potrebovali bi svetlobni vir s krajšo valovno dolžino. Na drugi strani so bili rezultati analize za populacijo večjih delcev jasnejši, kotna odvisnost, ki je ključna za kvalitetno karakterizacijo, pa zanesljiva. Pri večjih delcih nas je upoštevanje zgoraj omenjene vrednosti viskoznosti medija (1,2 mPas) za vzorce krvne plazme pripeljalo do vrednosti za parameter oblike ? ~ 1, ki je značilna za votle vezikularne strukture, in smo jo določili tudi za delce v razredčenih vzorcih izolatov in eksosomskega standarda. Na podlagi opravljenih eksperimentov izpostavljamo, da če naj bo rezultat analize odraz stanja v organizmu, je pri odvzemu pomembno preprečiti aktivacijo celic v vzorcu. Veliko k temu pripomore uporaba ogretih zbiralnikov in vzdrževanje temperature 37 °C vse do odstranitve celic iz vzorca. Zamrzovanje in filtracija sta pogosta predanalitska postopka, a imata na vzorce nepredvidljive učinke, ki jih v te delu nismo uspeli nedvoumno opredeliti. Pri vzorcih, zamrznjenih na –80 °C, po enkratnem odtajanju nismo opazili velikih razlik v primerjavi s svežimi. Dodatek trehaloze je pri tem potencialno koristen, vendar bi pred vpeljavo v splošno rabo bila potrebna določitev njene minimalne učinkovite koncentracije, opredelitev njenih interakcij z EV ter njenega učinka na viskoznost medija. Pri operativnih posegih z uporabo zunajtelesnega krvnega obtoka se značilno poveča populacija večjih delcev. Nadaljnje študije korelacij teh sprememb s post-operativnim razvojem zdravljenja nas morda lahko pripeljejo do novih izhodišč za izboljšanje terapije in izhoda zdravljenja za bolnike, zato upamo, da se bo raziskovanje na tem področju nadaljevalo.
B.06 Drugo
COBISS.SI-ID: 1537822659