Proteinska korona nastane ob stiku nanodelcev s tekočino, ki vsebuje proteine. Na področju nanomedicine je proteinska korona v veliki meri spregledana, kljub temu da številne študije kažejo na pomembnost le te za interakcijo nanodelcev z njihovo okolico. Čeprav je bilo v zadnjih letih preučenih veliko dejavnikov, pa so v literaturi še vedno nasprotujoči podatki o pomenu korone. Do sedaj tudi ni bila analizirana sestava disperzijskega medija. Preučili smo vpliv disperzijskega medija na sestavo proteinske korone kobalt-feritnih nanodelcev oplaščenih s poliakrilno kislino (PAA nanodelci) in industrijskih silicijevih nanodelcev. Z rezultati smo potrdili nekaj glavnih predpostavk o proteinski koroni, kot je na primer odvisnost sestave proteinske korone od tipa nanodelcev in. Pomembneje pa, smo kot prvi pokazali da tudi izbor disperzijskega medija vpliva na sestavo proteinske korone. Razlike v sestavi proteinske korone, ki je nastala ob stiku s fetalnim govejim serumom (FBS), so bile posledica različnih komponent disperzijskega medija, kot so dvovalentni ioni in makromolekule. Pokazali smo, da je sestava proteinske korone kompleksna funkcija sestave disperzijskega medija. Neodvisno od disperzijskega medija in koncentracije FBS je bila večina proteinov, ki so sestavljali proteinsko korono obojih nanodelcev, povezana s procesoma transporta in hemostaze. V koroni silicijevih nanodelcev smo zaznali tri proteine povezane s sistemom komplementa (faktor H, komplement C3 in komplement C4), medtem ko smo v koroni PAA nanodelcev zaznali samo en protein povezan z imunskim sistemom (?-2-glikoprotein). Relativna količina proteina komplementa C3 se je povečala, če so bili nanodelci dispergirani v NaCl, kar še dodatno nakazuje pomembnost disperzijskega medija. Vzpostavljeni protokoli so bili podlaga za vse nadaljnje analize proteomske karakterizacije ND po izpostavitvi humanemu serumu ali celičnemu mediju za analizo interkacije z makrofagi in PBMC celicami. 17 čistih citatov v dveh letih
COBISS.SI-ID: 11662676
V zadnjih letih intenzivno poteka razvoj novih formulacij nanodelcev, primernih za različne biomedicinske aplikacije, med katerimi so magnetni delci še posebej problematični zaradi svojega nerazgradljivega magnetnega jedra, ki ni stabilen v fizioloških pogojih. Da bi ta problem rešili, so preizkusili različna oplaščenja, vsakega s svojimi prednostmi in slabostmi, ki lahko vplivajo na efektivnost posamezne aplikacije. Temeljito razumevanje mehanizmov toksičnosti je zato pomembno za nadaljnji razvoj in izboljšave formulacij ND. V tej študiji smo se osredotočili na mehanizme toksičnosti dveh tipov s magnetnih delcev, oplaščenih s pozitivno nabitim polimerom poliakrilne kisline (PAA) ali z negativno nabitim polietileniminom (PEI). Poskusi na celični liniji B16 in primarnih humanih mioblastih so pokazali, da PAA ND ne povzročijo upada celičnega preživetja ali nastanka ROS in ne sprožijo imunskega odziva preko aktivacije transkripcijskega faktorja NF-kB (centralni transkripcijski faktor imunskega sistema). Po drugi strani pa s PEI oplaščeni ND povzročijo nekrotično celično smrt preko poškodb membrane, povečanje ROS in aktivacijo NF-kB 15-30 min po inkubaciji. Poskusi z inhibitorji so pokazali, da aktivacija NF-kB poteče preko TLR4 receptorjev. V vzporedni študiji (COBISS ID 10990164) smo želeli zmanjšati opaženo toksičnost PEI ND peko vezave molekul glutationa (GSH) na površino nanodelcev. S to dodatno plastjo smo želeli zmanjšati površinski naboj ND in znižati nastanek ROS preko antioksidantskih učinkov GSH. Poskusi izvedeni na celični liniji CHO so pokazali, da dodatno GSH oplaščenje zmanjša toksičnost ND, nastanek ROS in zmanjša porabo celokupne celične zaloge GSH. Presevna elektronska mikroskopija je pokazala, da celice še vedno lahko privzamejo oba tipa PEI ND, s fluorescenčno mikroskopijo pa smo potrdili, da oplaščenje z GSH ne zmanjša učinkovitosti PEI ND za transfekcijo celic s plazmidno DNA. Povezana publikacija: STROJAN, Klemen, LOJK, Jasna, BREGAR, Vladimir Boštjan, VERANIČ, Peter, PAVLIN, Mojca. Glutathione reduces cytotoxicity of polyethyleneimine coated magnetic nanoparticles in CHO cells. Toxicology in vitro, Jun. 2017, vol. 41, str. 12-20, [COBISS.SI-ID 11689556]
COBISS.SI-ID: 11691348
Krvno urinska bariera je najbolj neprehodna bariera v telesu in kot taka predstavlja problem za dostavo zdravilnih učinkovin pri intravezikalni terapiji. Znano je že, da je nizka stopnja endocitoze urotelijskih celic odvisna od stopnje njihove diferenciacije, a razlike med endocitozo pri normalnih in rakastih celicah še nismo izkoristili. V tem članku smo analizirali privzem in toskičnost z rodaminom B izotiocianat označenih kobalt feritnih nanodelcev oplaščenih s poliakrilno kislino (CoF- PAA) v štiri biomimetične modele urotelija; visoko in delno diferencirane normalne urotelijske celice ter rakave celice papilome urotelija in invazivne neoplazme urotelija. Pokazali smo, da rakave celice privzemajo nanodelce z izvihovanjem plazmaleme in zajemanjem agregatov nanodelcev v procesu makropinocitoze. S presevno elektronsko mikroskopijo in spektrofluorimetrično analizo smo pokazali, da je privzem delcev v znotrajcelični in medcelični prostor normalnih urotelijskih celic močno omejen, a izrazit pri rakastih celicah. Pokazali smo tudi, da je kvantifikacija privzema fluorescentno označenih nanodelcev na osnovi merjenja intenzitete fluorescence lahko zavajajoča in precenjena brez analize z elektronsko mikroskopijo. Naše ugotovitve doprinašajo k razumevanju endocitoze nanodelcev v rakave celice urotelija in kažejo visoko selektiven mehanizem za ločevanje rakavih in normalnih urotelijskih celic. Na osnovi te študije in analize proteinske korone analiziramo optmizacijo disperzijskega medija za optimalen selektivni vnos ND v rakave celice. Povezana objava: STROJAN, Klemen, LOJK, Jasna, BREGAR, Vladimir Boštjan, ERDANI-KREFT, Mateja, SVETE, Jurij, VERANIČ, Peter, PAVLIN, Mojca. In vitro assessment of potential bladder papillary neoplasm treatment with functionalized polyethyleneimine coated magnetic nanoparticles. Acta chimica slovenica, 2017, vol. 64, , 543-548, http://10.0.67.192/acsi.2016.2876, doi: 10.17344/acsi.2016.2876.[COBISS.SI-ID 11738452]
COBISS.SI-ID: 11794772
Povečano onesnaženost okolja v zadnjih desetletjih so predlagali kot enega od možnih razlogov za povečano incidenco nevrodegenerativnih in razvojnih bolezni. Za specifične tipe nanodelcev so pokazali, da lahko povzročijo poškodbe nevralnih celic in vivo preko poškodb krvno-možganske bariere, vnetij živčnega tkiva, povečane količine reaktivnih kisikovih intermediatov in agregacije proteinov. V tej študiji smo analizirali vpliv štirih tipov nanodelcev (biomedicinskih s polietileniminom oplaščenih kobalt feritnih nanodelcev (PEI) ter industrijskih TiO2 P25, TiO2 N in SiO2 nanodelcev) na znotrajcelično lokalizacijo in topnost proteinov FUS (angl. Fused in sarcoma) ter TDP-43 (angl. TAR-DNA binding protein 43), ki sta pomembna markerja nevrodegenerativnih bolezni amiotropne lateralne skleroze (ALS) in frontotemporalne lobarne degeneracije (FTLD). Rezultati so pokazali, da izbrani industrijski TiO2 N nanodelci povzročijo upad jedrne in povečanje citoplazemske frakcije proteinov FUS in TDP-43, kar je pričakovani odziv celice na stres, manjši upad viabilnosti a nič reaktivnih kisikovih intermediatov. Industrijski SiO2 nanodelci niso povzročili sprememb na celicah ali opazovanih proteinih, kar je verjetno posledica znatne agregacije nanodelcev in posledično manjšega privzema. Za razliko od ostalih pa so PEI nanodelci povzročili znaten upad viabilnosti preko poškodb membrane in številne nepredvidene spremembe; zmanjšali količino reaktivnih kisikovih intermediatov, povečanje jedrne količine proteina FUS in zmanjšali količino netopne (urea) frakcije FUS, kar je v nasprotju s pričakovanim odzivom na stres in namiguje, da so odzivi najverjetneje povezani preko skupnega mehanizma. Študija je pokazala, da izbrani nanodelci po kratkoročni in vitro izpostavitvi na povzročijo signifikantnih sprememb v lokalizaciji in topnosti proteinov FUS in TDP-43 ali stresnega odziva, vendar bi morali preučiti tudi posledice dolgoročne prisotnosti in akumulacije nanodelcev na proteine povezane z nevrodegenerativnimi boleznimi. Rezultate raziskave smo posredovali tudi v okviru COST akcije BIONECA Mojca Pavlin (vice-chair WG3), STMS izmenjava Jasna Lojk - Biotalentum, Budimšeta, Madžarska.
COBISS.SI-ID: 11728980
Izvedli smo zelo široko eksperimentalno študiji na modelu humanih makrofagov – celični liniji THP-1 za izbranih 10 tipov nanodelcev: industrijsko relevantnimi TiO2 in SiO2 ND, ter Food-grade (FG) TiO2 ND, ki se uporablja v hrani kot barvilo aditiv E171 in ki smo mu izpostavljeni v relativni velikih vsakodnevnih dozah (ocene iz literature 1.8 mg/kg. Določili smo koncentracijsko odvisno preživetje, sprožitev reaktivnih kisikovih zvrsti V nadaljevanju smo izvedli analizo sproščanja citokinov po izpostavitvi ND in sicer IL-6,IL-8, IL-1beta in TNFalfa, ki so pokazatelji stresnega in imunskega odziva. Za določene poskuse smo skupaj s KI izvedli analizo na wild-type in knock-out liniji mišjih makrofagov, da smo pokazali od inflamasoma odvisno aktivacijo imunskega sistema. Vzporedno smo izvedli karakterizacijo hidrodinamskega radija in zeta potenciala vseh izbranih ND tako v vodi kot tudi v relevantnem celičnem mediju proteomsko karakterizacijo proteinske korone in analizo nečistot z ICP-MS spektroskopijo. Kot ključen parameter se je pokazala velikost ND v vodi in v mediju, kjer večji delci v večini primerov prožijo večje odzive v obliki sporočanja citokinov IL8 in TNF alfa. Od različnih nečistot se je pokazala pozitivna korelacija pri bariju. Večina delcev razen srebrnih ni izkazovala velike toksičnosti. Zanimivo je, da sestava proteinske korone (npr. C3 fragment komplementa) ni vplivala na sproščanje citokinov, vpliv pa je imela celotna količina vezanih proteinov. Kot bolj imunogeni so se pokazali različni TiO2 ND, biomedicinski in silika pa kot manj imunogeni. Na osnovi tega smo napisali članek (v pripravi za oddajo v revijo Fiber and Nano Toxicology) za naslovom: Nanotoxicity and immunogenicity of engineered nanoparticles dependence on the physico-chemical properties and protein corona composition, avtorji: K. Strojan, J. Lojk, I. Hafner Bratkovič, A. Leonardi, I. Križaj, N. Drnovšek, S. Novak Krmpotič, P. Veranič, V.B. Bregar, M. Pavlin*, povabilo na predavanje na konferenci Bionanomed 2019.
COBISS.SI-ID: 11948372