Projekti / Programi
Prostorsko časovna analiza hipersenzitivnega odziva krompirja na krompirjev virus Y
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.05 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
Rastlinska biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| B191 |
Biomedicinske vede |
Rastlinska biokemija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 4.04 |
Kmetijske vede in veterina |
Kmetijska biotehnologija |
krompir, hipersensitivni odgovor, PVY, Potyviridae, prostorskočasovni odgovor, transkriptomika, redoks stanje, statistično in matematično modeliranje
Raziskovalci (14)
Organizacije (3)
Povzetek
Razumevanje interakcije med rastlinami in patogeni je nujno za zagotavljanje dolgotrajnega in okolju prijaznega sistema varstva rastlin. Krompir predstavlja eno izmed najbolj pomembnih poljščin in krompirjev virus Y (PVY) je eden izmed najbolj škodljivih patogenov, ki povroča svetovne izgube pridelka. Krompirjev kultivar Rywal odgovori na okužbo z virusom preko preobčutljivostnega odgovora (HR), kjer pride do pojava točkastih nekroz, ki omejijo premikanje virusa na mestu vstopa. V rastlinah NahG-Rywal z zmanjšano sposobnostjo akumulacije salicilne kisline pride do razvoja nekrotičnih lezij in niso sposobne ustaviti širjenja virusa, dodatno je njihov obrambni odgovor zakasnel. Cilj predlaganega raziskovalnega projekta so novi pogledi na razumevanje rastlinskega HR odgovora proti virusom, oz. bolj natančno identifikacija procesov, ki omejujejo širjenje virusa in njih ločba od procesov, ki vodijo v tvorbo lezij. Za dosego cilja bomo pripravili eksperimentalni sistem, ki bo omogočal prostorsko-časovno analizo rastlinskih odgovorov skupaj z omskimi analizami. Dalje se bomo poslužili in razvili inovativne pristope analize podatkov in matematičnega modeliranja za identifikacijo ključnih komponent/novih lastnosti omrežja rastlinske obrambne signalizacije.
Analizirali in primerjali bomo odgovore na nivoju transkriptoma in miRNA v obeh genotipih krompirja v dveh časovnih točkah po okužbi z PVY: 1) zgodnje namnoževanje virusa (mesto vstopa virusa pred razvojem lezij bo izrisano z uporabo GFP-označenega virusa pripravljenega v laboratoriju) in 2) zgodnji razvoj lezij (ko je nekrotično tkivo vidno na makroskopskem nivoju). Na zbranih malih sekcijah, ki bodo vsebovale nekaj 10 celic infekcijskega žarišča in okoljskega tkiva, bodo opravljene tarčne (qPCR) in ne-tarčne (RNA-seq) analize. Ker so glede na preliminarne poskuse zelo pomembne tudi spremembe v redoks potencialu, bomo opazovane genotipe transformirali s konstrukti, ki so sposobni zaznave redoks stanj, kar bo omogočalo in vivo prostorsko in časovno spremljanje redoks procesov v celicah. Te podatke bomo dopolnili z barvanjem na osnovi H2O2. Morfološke lastnosti celične smrti v obeh genotipih bomo opazovali s svetlobno mikroskopijo za zaznavo sprememb v permeabilnosti membrane in nalaganja kaloze; spremembe na ultrastrukturnem nivoju bomo spremljali z elektronsko mikroskopijo.
Strukturo upravljanja in hrambe podatkov, ki bo omogočala učinkovite analize, dostopnost podatkov vsem partnerjem, komunikacijo z javnimi bazami podatkov in večkratno uporabo podatkov, bomo postavili v skladnosti z FairDom konceptom. Pripravljena struktura bo tudi sposobna implementacije novo razvitih delotokov za analizo podatkov, na osnovi integracije predznanja in specifično prilagojena za prostorsko-časovne študije (statistično modeliranje) ter nizke količine začetnega materiala. Dalje bomo integrirali koncepte prostorske statistike, multivariatne statistike in omrežne analize za identifikacijo ključnih komponent omrežja rastlinske obrambne signalizacije, ki bo, družno z modeliranjem na osnovi predznanja omogočilo nove poglede na razumevanje obrambne signalizacije. Vzporedno bomo razvili/izboljšali možnosti vizualizacijo eksperimentalnih podatkov RNA/miRNA.
Projektno skupino sestavljajo odlični znanstveniki iz različnih raziskovalnih organizacij, tako iz Slovenije (NIB, BF, Genialis) kot tujine (PAS, AU, CIPF), kar je potrebno zaradi interdisciplinarne narave projekta in zagotavljanja potrebne infrastrukture za izvedbo projekta. Rezultati projekta bodo razširjeni preko visoko uvrščenih znanstvenih člankov, na znanstvenih zborih in lokalno v medijih ter delavnici.
Najdbe projekta bodo končno doprinesle k izboljšavam v vzgoji rastlin, e.g. pri razvoju krompirja odpornega na okoljske dejavnike, kar trenutno predstavlja omejitev pri optimizacije donosa te pomembne poljščine. dodatno, predlagani eksperimentalni pristop in znanje bo prenosljivo tudi na druge sisteme gostitelja-patogena ter razvita tehnolog
Pomen za razvoj znanosti
Kompleksne biološke procese, kot sta na primer signalizacija in mreže metabolnih poti, lahko razumemo le, če sočasno preučujemo vse komponente sistema. V zadnjih desetletjih je bil narejen izjemen napredek na področju novih tehnik v molekularni biologiji, s čimer so omogočene analize majhnega števila celic in celo posameznih celic. Do sedaj je bila dinamika signalizacije v imunskem odgovoru rastlin preučevana večinoma v materialu, dobljenem s homogenizacijo celih listih, čeprav vemo, da so z virusom okuženi listi zgrajeni iz zelo heterogene mešanice celic, ki so zaradi različne oddaljenosti od mesta vstopa virusa v list v različnih fazah obrambnega odgovora.
Izvirnost v projektu predlaganega pristopa se kaže v kombinaciji uporabe fluorescentno označenega klona virusa, za posamezne organele specifičnih senzorjev redoks stanja, različnih tehnik mikroskopije ter ‘omskih‘ analiz za analize majhnih koščkov tkiva, s čemer bo omogočeno podrobno prostorsko in časovno sledenje odgovora krompirja na virusno okužbo. Kompleksnost predlagane nove raziskovalne smeri pa se kaže v predvidenih analizah vloge miRNA v regulaciji obrabnega odgovora rastlin na povzročitelje bolezni. Splošno je namreč znano, da ima gradient miRNA pomembno vlogo v razvoju rastne, do sedaj pa še ni bilo pokazano, da bi bil vpleten tudi v prostorsko regulacijo obrambnega odgovora rastline. Na podlagi združevanja obstoječega znanja bomo razvili nove postopke za obdelavo podatkov in jih prilagodili za prostorske in časovne študije (statistično modeliranje) in študije iz majhnih količin začetnega materiala.
Poleg tega bomo z matematičnim modeliranjem podpirali generiranje novih bioloških hipotez. Predvidevamo, da bomo identificirali nove dejavnike v obrambnem odgovoru krompirja in nove značilnosti signalizacijske mreže v imunskem odgovoru. Zato bo znanje, pridobljeno v predlaganem projektu, z razumevanjem molekularnih mehanizmov, ki sledijo aktivnosti R-proteinov in ki določajo izid interakcije, predstavljalo preboj v razumevanju interakcij med rastlinami in virusi. Razviti eksperimentalni pristopi in znanje bodo prenosljivi tudi na druge rastlinske vrste in druge povzročitelje bolezni, razvite tehnologije pa tudi na druge biotehnološke aplikacije.
Pomen za razvoj Slovenije
Trenutno je krompir tretja najpomembnejša poljščina namenjena prehrani v svetovnem merilu. Na hektar proizvede velike količine nealergenih rastlinskih beljakovin ter vsebuje številne vitamine in druge zdravju koristne snovi, zato pomen krompirja v prehrani v državah v razvoju narašča. Trenutno zaradi velikih vložkov, potrebnih za zagotavljanje ustreznega pridelka ter dovzetnosti krompirja za biotski in abiotski stres, proizvodnja krompirja še vedno ni optimalna. Krompir gojijo v vseh državah EU, katerih proizvodnja znaša približno 1/3 svetovne proizvodnje. V Sloveniji je krompir tradicionalno najpomembnejša poljščina.
PVY je poleg krompirjeve plesni (Phytophtora infestans) glavni povzročitelj bolezni krompirja in povzroča velike izgube pridelka (od 10% do 80%, odvisno od sorte) tako v Sloveniji kot tudi drugod po svetu. Zdravljenje krompirja, okuženega s PVY, s kmetijsko prakso ni mogoče. Najboljša strategija za kontrolo bolezni je žlahtnjenje odpornih in tolerantnih sort ter uporaba brez virusnega semenskega krompirja v kombinaciji s strategijami za kontrolo prenašalcev (žuželk). V osemdesetih letih prejšnjega stoletja je epidemija PVY popolnoma ustavila pridelavo občutljivih sort krompirja, ki so bile tedaj vodilne, ter ustavila proizvodnjo semenskega krompirja v Sloveniji.
Pred kratkim je projekta skupina skupaj s Kmetijskim inštitutom Slovenije, Inštitutom Jožef Stefan ter slovenskimi semenarkimi, agrokemičnimi in inovativnimi tehnološkimi podjetji podala iniciativo »Trajnostno kmetijstvo - sorte za prihodnost«, v okviru katere bo ponovno vzpostavljena veriga trajnostne proizvodnje krompirja v Sloveniji in ki bo prispevala k boljši samooskrbi Slovenije s hrano. Na ta način bodo znanstvena odkritja povezana s končnimi uporabniki. Iniciativa je bila prepoznana kot pomembna v perspektivi slovenske pametne specializacije znotraj prioritete trajnostna proizvodnja hrane. V okviru predlaganega projekta bomo razvili znanstveno osnovo za precizno žlahtnjenje na stres prilagodljivih sort. Boljše razumevanje interakcij med rastlinami in povzročitelji bolezni je namreč predpogoj za oblikovanje izboljšav v kmetijski praksi.
Dodaten vidik predlagane raziskave je tudi razvoj novih tehnologij za raziskave kompleksnih bioloških procesov. Metodološki principi, razviti v okviru predlaganega projekta, se bodo kasneje lahko enostavno prilagodili za raziskave drugih bioloških sistemov, na primer tistih, ki bodo pomembni za zainteresirane partnerje iz farmacevtske in biotehnološke industrije. Sodelavci na predlaganem projektu imajo vzpostavljeno tesno sodelovanje s številnimi farmacevtskimi in biotehnološkimi podjetji (Lek, Krka, Bia, BiaSeparations, Omega, BioSistemika) na področju razvoja metod molekularne biologije in njihove vpeljave v industrijsko okolje. Tako bodo v okviru predlaganega projekta razviti eksperimentalni pristopi in postopki analiz podatkov lahko prenešeni tudi na druge aplikacije.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
