Projekti / Programi
Ovrednotenje Nef-vsebujočih zunajceličnih veziklov v plazmi kot biooznačevalca aktivnega rezervoarja virusa HIV-1 pri aviremičnih posameznikih
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.01.00 |
Medicina |
Mikrobiologija in imunologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B510 |
Biomedicinske vede |
Infekcije |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
zunajcelični vezikli, HIV-1, virusni rezervoarji, Nef, biooznačevalec, immunoizolacija, ELISA, kvantitativni PCR
Raziskovalci (13)
Organizacije (3)
Povzetek
HIV-1 je še vedno pomemben zdravstveni problem v mnogih regijah po svetu. Ker je razvoj ustreznega cepiva izredno kompleksen, je vedno več truda vloženega v izboljšanje uravnavanja infekcije in kvalitete življenja okuženih posameznikov. Po ocenah SZO je bilo l. 2016 s HIV okuženih približno 36,7 milijonov ljudi, pri čemer je več kot polovica prejemala protiretrovirusno terapijo (ART). Kljub ART se virus razširi in skrije v rezervoarje razpršene po celem telesu okuženih posameznikov, pri čemer CD4+ celice T predstavljajo največji delež. Obstoj rezervoarjev predstavlja glavno oviro za popolno izkoreninjenje virusa, zato je bilo v zadnjih letih veliko raziskav usmerjenih v razvoj metod za določitev velikosti latentnega rezervoarja HIV-a. Nedavne raziskave, ki so dokazale prisotnost virusnega proteina Nef v polovici aviremičnih bolnikov okuženih s HIV, pa so nakazale tudi na obstoj rezervoarja, ki je translacijsko aktiven. Ta aktivni rezervoar bi lahko prispeval h kronični imunoaktivaciji in posledično obolenjem, nepovezanim z AIDS-om.
Za študij tega najprej potrebujemo enostaven in natančen test, ki bo kvantificiral aktivni rezervoar HIV-a, in Nef-zunajcelični vezikli (ZV) v plazmi so dober kandidatni biooznačevalec. Nef je namreč zgodnji virusni transkript, ki ne potrebuje ostalih virusnih proteinov za močno izražanje v okuženi celici. Nef vpliva na raznolike znotrajcelične procese, izloča pa se tudi zunajcelično z vključitvijo v virione in tudi ZV-je. Izražanje Nef-a v celici vpliva na lipidno, proteinsko in miRNA sestavo ZV-jev, ter na njihovo velikost. Nef-ZV-jipovzročijo apoptozo CD4+ celice T, nevrotoksičnost in poškodujejo krvno-možgansko pregrado. Iz povedanega sledi, da se Nef-ZV-ji v plazmi aviremičnih posameznikov značilno razlikujejo od ZV-jev, ki jih sproščajo neokužene celice.
ZV-je izločajo vse celice v kulturi, v visokih koncentracijah pa se nahajajo tudi v vseh telesnih tekočinah, tudi krvi. Proteinska, nukleinska (miRNA) in lipidna sestava ZV-jev odraža sestavo in (pato)fiziološko stanje starševske celice. Zaradi omenjenih karakteristik in ker jih lahko enostavno izoliramo iz dostopnih telesnih tekočin, so pogosto študirani kot biooznačevalci raznolikih bolezni, vendar študija za okužbo s HIV-om še ni bila izvedena.
Namen predlagane raziskave je ovrednotiti Nef-vsebujoče ZV-je kot plazemski biooznačevalec aktivnega rezervoarja HIV pri aviremičnih posameznikih. Natančneje, izvedli bomo poglobljeno karakterizacijo Nef-ZV-jev, ki se sproščajo iz humanih CD4+ celice T in mikroglij, ki ektopično izražajo protein Nef, in identificirali: specifične površinske proteine, ki jih bomo uporabili pri razvoju imunoizolacijske metode za obogatitev Nef-ZV-jev iz raznolikih virov (cilj 1); specifični proteinski in miRNA tovor Nef-EV-jev, ki ga bomo uporabili za razvoj metode za detekcijo Nef-EV-jev in za identifikacijo tipa starševske celice (cilj 2). Te novo razvite metode bomo uporabili za kvantifikacijo Nef-ZV-jev v plazmi večjega števila aviremičnih posameznikov ter preučili povezavo med koncentracijo Nef-EV-jev in velikostjo virusnega rezervoarja ter ostalih kliničnih značilnosti preiskovancev (cilj 3). Hipoteza predlagane raziskave je, da koncentracija Nef-ZV-jev v plazmi kaže na obseg in celični vir aktivnih rezervoarjev virusa v aviremičnih, s HIV-om okuženih posameznikih. Koncentracija Nef-ZV-jev je povezana vsaj z nekaterimi kliničnimi značilnostmi preiskovancev. Nef-ZV-ji v plazmi so posledično ustrezen biooznačevalec aktivnih rezervoarjev HIV-a v aviremičnih posameznikih.
Predlog predstavlja popolnoma nov pristop k diagnostiki HIV-a in je prvi korak pri razvoju kliničnega testa za določitev obsega aktivnih rezervoarjev HIV-1, s katerim bi lahko rutinsko merili stanje pacienta. Sledenje Nef-ZV v krvi bi lahko pripomoglo k prilagoditvi zdravljenja, lahko pa bi celo napovedali klinični potek bolezni. To bi vodilo k izboljšanju kvalitete življenja okuženih posameznikov in
Pomen za razvoj znanosti
Predlog predstavlja popolnoma nov pristop k diagnostiki HIV-a, saj bo raziskal zunajcelične vezikle (ZV-je) v plazmi, trenutno še popolnoma neraziskan vir biooznačevalcev povezanih z infekcijo s HIV. Postopek temelji na detekciji Nef-ZV-jev v plazmi, kjer se kopičijo ZV-ji sproščeni iz bližnjih in oddaljenih s HIV-om okuženih celic, ter tako kažejo na stanje dostopnih in odročnih telesnih rezervoarjev HIV-a. Za namene študije bomo dostopali do zbirke SCOPE (sodelovanje s prof. Steven G. Deeks, MD, ko-direktorjem zbirke), ki združuje več kot 1500 vzorcev plazme klinično okarakteriziranih prostovoljcev okuženih s HIV-1 in tako predstavlja najpomembnejšo zbirko za študij HIV rezervoarjev.
Študija bo tudi pomembno prispevala k razumevanju aktivnih HIV rezervoarjev, sposobnih nizkega izražanja virusnih proteinov. Ta koncept trenutno sproža veliko zanimanja, saj postavlja pod vprašaj splošno sprejet model latence (popolno utišanje izražanja virusa) in predpostavi prisotnost virusnih proteinov (Nef) v telesnih tekočinah aviremičnih, s terapijo ART zdravljenih posameznikov. Ta bi lahko prispevali h kroničnemu vnetju pogosto opaženem pri teh bolnikih.
S terapijo ART se je infekcija s HIV-om spremenila iz progresivne, tipično smrtne bolezni, v kronično bolezen, ki vpliva na zdravo staranje in s tem obremenjuje zdravstveni sistem. Naš projekt je prvi korak pri razvoju kliničnega testa za določitev obsega aktivnih virusnih rezervoarjev, s katerim bi lahko rutinsko merili stanje pacienta. Sledenje biooznačevalca Nef-ZV v krvi bi lahko pripomoglo k prilagoditvi zdravljenja, lahko pa bi celo napovedalo klinični razvoj bolezni. To bi pripomoglo k izboljšanju kvalitete življenja okuženih posameznikov in tudi k zmanjševanju obremenitve zdravstvenega sistema. Izsledke poglobljene karakterizacije Nef-ZV-jev bi lahko v prihodnosti uporabili tudi za razvoj terapevtikov za nevtralizacijo toksičnih Nef-ZV-jev.
Postavili bomo tudi metode za specifično izolacijo in detekcijo Nef-ZV-jev v plazmi, ki bi lahko služile kot platforma za raziskave ZV-jev kot biooznačevalcev katerekoli bolezni. Naš pristop namreč reši eno od slabosti pri študiju ZV-jev kot biooznačevalcev, to je razredčitev z boleznijo povezanih ZV-jev v celotni populaciji ZV-jev v plazmi. Ta razredčitev vpliva na identifikacijo specifičnih, z boleznijo povezanih ZV-jev oz. njihovega tovora, kasneje pa tudi na občutljivost testa za detekcijo biooznačevalca.
Izvirnost rezultatov predlagane študije bi tudi pomembno prispevala k mednarodni prepoznavnosti slovenske znanosti na hitro razvijajočem področju zunajceličnih veziklov. Raziskava bo pripomogla k izboljšanju poučevanja in usposabljanja osebja, saj je večina sodelavcev na projektu vpletena v poučevanje na dodiplomskem in podiplomskem študiju, hkrati pa tudi mentorirajo diplomske, magistrske in doktorske študente. Močno smo vpleteni tudi v promocijo lokalnih raziskav ZV-jev, s pomočjo organizacije letnih delavnic, s pošiljanjem mesečnih obvestil na temo ZV-jev na e-skupino s 70 člani in s širjenjem znanstvenih dognanj širši publiki.
Pomen za razvoj Slovenije
The proposal is a completely new approach to HIV diagnostics, as it will explore plasma extracellular vesicles (EVs) as so far unexplored resource of HIV-infection related biomarkers, which would parallel similar approaches to cancer and neurodegenerative diseases. The approach is based on detecting Nef-EVs in plasma, where EVs released from nearby or remote infected cells accumulate, and are therefore indicative of the state of accessible and remote body HIV reservoirs. Importantly, we will access the SCOPE cohort (collaboration with prof. Steven G. Deeks, MD, bank co-director; UCSF, USA) of more than 1500 samples of HIV-1 infected volunteers with carefully characterized clinical data.
The study will also importantly contribute to the understanding of leaky HIV reservoirs, the concept that is attracting a lot of interest recently, as it questions the previously accepted model of latency (complete shutdown of viral expression). It suggests that low level of viral proteins are present in body fluids, which could contribute to chronic inflammation seen in virally suppressed, ART-treated individuals.
ART has transformed HIV infection from a progressive, typically fatal infection to a chronic disease, impacting healthy aging and burdening the health care system. Our project is the first step in developing a clinical assay for measuring the leaky HIV reservoir that could be routinely used to monitor patient’s status. Following the Nef-EV biomarker in the blood could help adjust treatments and maybe even predict clinical outcomes, which would improve the life of many of HIV infected patients and also benefit the health care systems. Importantly, the in-depth characterization of Nef-EVs described in the current proposal could in the future be used for development of therapeutics targeting these toxic Nef-EVs.
We will also establish methods for specific isolation and detection of plasma Nef-EVs, which could serve as an EV biomarker discovery platform for any disease. Our approach namely overcomes one of the weaknesses of EVs as biomarkers, that is the dilution of disease-related EVs in the pool of plasma EVs, which affects identification of unique, disease-related EV-molecules and later also the sensitivity of biomarker detection assay.
The novelty of the described research would also contribute importantly to the international recognition of Slovenian science in the newly developing research field of extracellular vesicles. The research will also contribute to the improvement of teaching and training of personnel, as most of the project co-workers are also involved in teaching at undergraduate and postgraduate levels and are mentoring Bachelor degree, master degree and PhD students. We are also very involved in promoting regional EV research through organizing yearly workshops, administrating the EV-focused monthly e-mailing list with 70 subscribers and organizing science outreach activities.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
