Projekti / Programi
NOVE PROTIMIKROBNE STRATEGIJE PREPREČEVANJA TVORBE BIOFILMA Z UPORABO LEKTINOV, KI INHIBIRAJO BAKTERIJSKO ADHEZIJO
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.03.07 |
Biotehnika |
Rastlinska produkcija in predelava |
Tehnologija živil rastlinskega izvora |
| Koda |
Veda |
Področje |
| T430 |
Tehnološke vede |
Tehnologija hrane in pijač |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 4.01 |
Kmetijske vede in veterina |
Kmetijstvo, gozdarstvo in ribištvo |
adhezija, listerija, biofilm, lektin, gobe, mehanizem, protimikrobno delovanje, mikrofluidika, adhezin, patogena bakterija, okužba z živili
Raziskovalci (17)
Organizacije (3)
Povzetek
V predlaganem projektu bomo razvili alternativni pristop za omejitev naraščajočega pojava odpornosti proti antibiotikom preko boja proti bakterijskim okužbam s preprečevanjem prvega stika bakterij s površinami, torej s preprečevanjem bakterijske adhezije in nadaljnje tvorbe biofilma. Osredotočili se bomo na patogeno Gram-pozitivno bakterijo Listeria monocytogenes kot modelni organizem za analizo mehanizmov adhezije preko proteinov, ki vežejo glikane - lektinov (tako endogenih kot eksogenih), saj bakterijski površinski glikani močno vplivajo na interakcijo bakterij s površinami. Drugi cilj predlaganega projekta je razviti izboljšano metodo za proučevanje adhezije bakterij in tvorbe biofilma z uporabo fluorescence ali luminiscence v mikrofluidni platformi, ki bo omogočala zgodnjo detekcijo biofilmov.
L. monocytogenes povzroča listeriozo, ki je zaradi zelo visoke stopnje smrtnosti najhujša zoonoza v EU. Prenaša se z uživanjem kontaminirane hrane, saj L. monocytogenes lahko preživi in raste v kislih, slanih in hladnih pogojih in se pogosto nahaja na gotovih živilih, v mlečnih izdelkih, na surovi zelenjavi in sadju, ker zelo uspešno kolonizira okolja za predelavo hrane. Neverjetna vztrajnost L. monocytogenes je razvidna iz zadnjih izbruhov v EU, ki trajata od leta 2015 in obsegata več držav.
Prvi korak pri tvorbi biofilma je adhezija planktonskih bakterij na površino, ki ji sledi celična proliferacija in proizvodnja zunajceličnih polimernih snovi. Za razliko od biofilmov mnogih drugih bakterij, kjer prevladujejo polisaharidi, so v zunajceličnem matriksu L. monocytogenes proteini najbolj zastopani in so tudi najpomembnejše determinante adhezije in nadaljnjega razvoja in vzdrževanja biofilma. Zato se bodo naše raziskave osredotočile predvsem na proteine znotraj zunajceličnih polimernih snovi. Naši predhodni rezultati so pokazali, da več izoliranih gobjih lektinov vpliva na adhezijo bakterij na polistiren.
Potek dela bo vključeval pripravo funkcionalnih rekombinantnih lektinov iz višjih gliv (DS1) in sočasen razvoj izboljšane metode (DS2) za proučevanje adhezije bakterij in tvorbe biofilma z uporabo fluorescenčnih bakterij in mikrofluidne platforme, ki omogoča časovno spremljanje in uporabo konfokalne mikroskopije. Z uporabo novo razvitih izboljšanih metod bomo ovrednotili učinke izbranih lektinov na adhezijo (DS3) na abiotske in biotske površine v statičnih in dinamičnih biofilmih. Temu bo sledila identifikacija tarčnih in drugih molekul, vključenih v adhezijo in tvorbo biofilma (DS4), vključno z analizo zunajceličnih polimernih snovi in arhitekture biofilma. Molekule, ki jih vežejo eksogeni lektini, bomo izolirali z uporabo lektinske afinitetne kromatografije in endogene lektine bodo identificirali s kompetitivnim testom z glikani. Nazadnje bomo opisali mehanizem procesa adhezije (DS5) z validacijo tarčnih molekul in predlagali nove strategije za preprečevanje kontaminacije površin z L. monocytogenes.
Predlagani projekt bo realiziran s sodelovanjem treh raziskovalnih skupin, ki imajo dostop do vse potrebne opreme za uspešno dokončanje predlaganega projekta v treh letih. Skupina z Instituta Jožef Stefan (IJS) pod vodstvom dr. Jerice Sabotič bo koordinirala projekt (DS6) in zagotovila znanje na področju karakterizacije proteinov, mikroskopije in celične biologije. Skupina iz istega oddelka, ki jo vodi doc. dr. Aleš Berlec ima strokovno znanje na področju inženiringa G+ bakterij. Mikrofluidno platformo za raziskavo nastajanja biofilmov bo razvila raziskovalna skupina pod vodstvom dr. Tadeja Kokalja z Inštituta za kovinske materiale in tehnologijo (IMT). Skupina, ki jo vodi doc. dr. Anja Klančnik z Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani (BF) bo nudila strokovno znanje na področju razvoja biofilma, mehanizma protimikrobne odpornosti in bakterijske komunikacije.
Pomen za razvoj znanosti
Predlagani projekt neposredno naslavlja družbeni cilj AMR – Protimikrobna odpornost Pobude za skupno načrtovanje programov Evropske komisije saj bo naš glavni cilj koristil razvoju alternativnih strategij nadzora mikroorganizmov. Te so nujno potrebne za bakterijo Listeria monocytogenes, saj je v poročilu za leto 2017 EFSA razglasila listeriozo za najhujšo zoonozo v EU z najvišjo stopnjo hospitalizacije in smrtnosti.
V korist znanstvenih področij biotehnologije in mikrobiologije bomo razvili izboljšano metodo za proučevanje bakterijske adhezije z uporabo fluorescenčnih in/ali bioluminiscenčnih bakterij, ki omogočajo neposredno detekcijo v zgodnjih fazah razvoja biofilma. Poleg tega bo uvedba uporabe mikrofluidike za proučevanje dinamičnih biofilmov razširila njihovo uporabnost. Te izboljšane metode bodo imele velik potencial za uporabo v študijah drugih patogenih bakterij, ki se prenašajo s hrano, in sicer G + (npr. Bacillus, Staphylococcus) in G– (Salmonella, Campylobacter, E. coli, Yersinia).
Projekt bo zagotovil neprecenljiv nov vpogled v začetne faze tvorbe bakterijskega biofilma z identifikacijo novih proteinov, ki vežejo glikane in so vključeni v proces adhezije na površine in/ali interakcije med bakterijami. Poleg tega uporaba lektinov iz višjih gliv predstavlja izviren vidik predlaganega projekta. Le podrobno razumevanje procesa adhezije lahko vodi do razvoja novih sredstev, ki se lahko uporabijo v živilski in medicinski biotehnologiji za preprečevanje nastajanja biofilmov. Novo opisane molekule bodo omogočile načrtovanje novih strategij za nadzor in preprečevanje nastajanja biofilma v živilski industriji ter v humani in veterinarski medicini. Pričakujemo, da bomo dobili vpogled v adhezijo listerij na različne tipe celic, kar lahko vodi do novih raziskovalnih smernic za preprečevanje primarne in/ali sekundarne okužbe pri ljudeh. Prednost alternativnih protimikrobnih sredstev, ki vplivajo na adhezijo, je omejevanje mikrobne kolonizacije v zgodnjih fazah. S tem prispevajo k zmanjšanju uporabe antibiotikov kot tudi razvoja AMR zaradi nizkega evolucijskega pritiska. Poleg tega se lahko uporaba na novo identificiranih protimikrobnih strategij razširi na druge patogene Gram-pozitivne bakterije, kot so tiste iz rodov Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus. Končno bomo delali izključno z vodotopnimi molekulami, kar jim daje prednost pred številnimi protimikrobnimi sredstvi, ki so pogosto slabo vodotopni, kar omejuje njihovo uporabnost. V sektorjih proizvodnje in predelave živil bo znanje koristno za razvoj ustreznih ocen mikrobioloških tveganj v živilski verigi in distribuciji, kar prispeva k varnejšemu okolju za predelavo hrane.
Projekt bo omogočil usposabljanje mladih znanstvenikov, saj bodo vanj vključeni tudi doktorski in magistrski študenti. Poleg tega je naša raziskovalna skupina vključena v pobudo Metrologija ogljikovih hidratov za spodbujanje glikoznanosti v Evropi, s čimer bodo naši rezultati takoj dostopni široki skupnosti.
Pomen za razvoj Slovenije
The proposed project directly addresses the EC Joint Programming Initiative on Antimicrobial Resistance (AMR) as our main objective will benefit development of alternative microbial control strategies. These are critically needed for Listeria monocytogenes since listeriosis was reported by EFSA as the most severe zoonosis in the EU in 2017 with the highest hospitalization and mortality rate.
To benefit the fields of biotechnology and microbiology an improved method to study bacterial adhesion will be developed using bioengineered bacteria enabling direct detection during early steps of biofilm development. Moreover, introducing the use of microfluidic techniques to study dynamic biofilms will broaden their applicability. These improved methods will have great potential to be used for studies of other foodborne pathogenic bacteria both G+ (e.g. Bacillus, Staphylococcus) and G– (Salmonella, Campylobacter, E. coli, Yersinia).
This project will provide invaluable new insights into the initial steps of bacterial biofilm formation by identification of new glycan-binding proteins involved in the process of adhesion to surfaces and/or interaction between bacteria. Furthermore, the use of lectins from higher fungi represents an original aspect of this project proposal. Only detailed understanding of the adhesion process can lead to development of new agents for use in food and medical biotechnology to prevent biofilm formation. It will enable us to propose new strategies for control and prevention of biofilm formation in the food industry and in human and veterinary medicine. We expect to get insight into the adhesion of Listeria to relevant cell types, which can provide new research directions for prevention of primary and/or secondary infection. The alternatives to antibiotics that affect adhesion have the advantage of limiting the microbial colonization in the early stages, and they therefore contribute to reduced use for antibiotics as well as AMR development since they provide little evolutionary pressure on the pathogen. Furthermore, the use of any new antimicrobial strategies identified can be extended to the control of other pathogenic Gram positive bacteria such as those from the genera Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus. Finally, we will be working exclusively with water soluble molecules, which gives them an advantage over many antimicrobial agents with limited value due to poor water solubility. In the food production and processing sectors the knowledge gained here will be useful for the development of appropriate quantitative microbial risk assessment for the food-production chain and distribution contributing to safer food processing environment.
The project will enable training of young scientists since PhD students as well as Master students will be included. Furthermore, we are involved in the initiative Metrology of Carbohydrates for glycoscience promotion in Europe, which will make our data instantly relevant to a wide audience.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
