Projekti / Programi
Genska tehnologija za fermentacijsko proizvodnjo biološko aktivnih beljakovin
01. januar 1999
- 31. december 2003
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.00 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| P320 |
Naravoslovno-matematične vede |
Nukleinske kisline, sinteza beljakovin |
| P310 |
Naravoslovno-matematične vede |
Beljakovine, encimologija |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
kvasovke, P.pastoris, S.cerevisiae, CDC6, celični cikel; nitaste glive, A.niger, TNF, G-CSF, EK, steroidi, izražanje heterolognih genov, izločanje proteinov, sekrecija; proteinsko inženirstvo, izolacija proteinov, farmacevtska uporaba, analogi TNF, E.coli
Raziskovalci (18)
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0104 |
Kemijski inštitut |
Ljubljana |
5051592000 |
21.476 |
Povzetek
Program predlagane programske skupine je zasnovan na dolgoletnih izkušnjah in dosežkih na področju biokemijskih, molekularno bioloških in biotehnoloških raziskav nižjih evkariontov, predvsem nitastih gliv: Skupina je v sedemdesetih in osemdesetih letih uvedla submerzno proizvodnjo ergot alkaloidov z nitastimi glivami rodu Claviceps in to prenesla v Tovarno farmacevtskih in kemičnih izdelkov LEK, ki je tako danes eden največjih svetovnih proizvajalcev omenjenih alkaloidov. To lahko smatramo za enega največjih dosežkov slovenske biotehnologije. V devetdesetih letih je svojo raziskovalno dejavnost razširirila na področje genskega oziroma proteinskega inženirstva za biosintezo biološko aktivnih in farmakološko uporabnih rekombinantnih proteinov, kjer je z načrtovanjem, kloniranjem in izražanjem genskih konstruktov v bakteriji E.coli pridobila številne analoge človeškega faktorja tumorske nekroze z izboljšanimi terapevstkimi lastnostmi, od katerih so nekateri uspešno prestali predklinične preizkuse na Onkološkem inštitutu v Ljubljani, eden pa je tudi že pripravljen za klinično preizkušanje - kot prvo potencialno rekombinantno zdravilo v Sloveniji. Ker imajo nižji evkarionti (kvasovke, nitaste glive) številne prednosti za izražanje heterolognih genov oziroma za pridobivanje heterolognih rekombinantnih proteinov (visoka produkcija, zmožnost posttranslacijskih modifikacij, izločanje proteinov v gojišče in zato njihova enostavnejša izolacija in čiščenje, GRAS status za humano uporabo varnih organizmov), je program skupine usmerjen v uvajanje postopkov za pridobivanje velikih količin zelo čistih rekombinantnih proteinov v ekspresijsko-sekrecijskih sistemih nižjih evkariontov. To zajema celotno verigo potrebnih raziskav in metodoloških pristopov: od biokemijskih in molekularno-bioloških raziskav nekaterih osnovnih življenskih lastnosti nižjih evkariontov, načrtovanja genskih konstruktov in njihovega izdelovanja s pomočjo verižnega pomnoževanja DNA (PCR), usmerjene mutageneze "in vitro" ter kloniranja v bakteriji E.coli, preko raziskav izražanja heterolognih genskih konstruktov v kvasovkah in nitastih glivah, raziskav procesiranja ter mehanizmov izločanja rekombinantnih proteinov, vse do optimizacije biosinteze in prenosa fermentacij v laboratorijske bioreaktorje ter nato proučevanja postopkov izolacije in prečiščevanja rekombinantnih produktov in na koncu nekaterih osnovnih bioloških testov njihovih lastnosti. Pri kvasovki S.cerevisiae bomo proučevali proteine, za katere domnevamo, da sodelujejo v njenem celičnem ciklu. Z računalniškim načrtovanjem in ustreznimi postopki tehnologije r-DNA bomo izdelovali genske konstrukte za izražanje TNF, G-CSF, EK, nekaterih encimov steroidnega metabolizma itd. ter za analoge omenjenih proteinov , ki jih bomo poskušali izraziti v kvasovki P.pastoris oziroma nitasti glivi A.niger, obenem pa jih bomo uporabljali tudi kot modelne molekule za proučevanje mehanizmov sekrecije pri nitastih glivah. Za proučevanje metod čiščenja rekombinantnih proteinov se bomo posluževali dodatnih korakov proteinskega inženirstva. Pridobljenim rekombinantnim molekulam bomo s poskusi na celičnih kulturah določali njihove osnovne biološke lastnosti, v sodelovanju z drugimi ustanovami pa tudi njihove farmakološke lastnosti oz. terapevtsko/biotehnološko uporabnost.
Pomen za razvoj znanosti
A/ Delitev celice je osnovno biološko vprašanje, razumevanje uravnavanja teh procesov na molekulski ravni pa je že nekaj let osrednja tema molekularne biologije. Različne degenerativne bolezni skupaj s staranjem in rakastimi obolenji, kot tudi virusne infekcije, so povezane z delitvijo celice. Razumevanje teh procesov je zato ključnega pomena za razvoj sodobne medicine in farmacije. Možnost bolj načrtnega nadzorovanja celične delitve je zanimiva tudi pri vodenju fermentacijskih procesov v biotehnologiji. B/ Prispevek k razumevanju post-translacijskega procesiranja in mehanizmov sekrecije proteinov pri nitastih glivah bi bil zagotovo pomemben v biotehnologiji. Želimo priti do novih spoznanj o konstrukciji uspešnih sistemov vektor - gostitelj za kloniranje/izražanje heterolognih genov pri nitatstih glivah in kvasovkah. Za biotehnologijo bodo pomembni tudi novi pristopi pri izolaciji, čiščenju in reaktivaciji rekombinantnih heterolognih proteinov.
C/ Z načrtovanjem novih analogov nekaterih terapevtsko oz. biotehnološko zanimivih proteinov bomo poskušali pridobiti molekule z izboljšanimi lastnostmi, ki bodo obenem lahko tudi modelne molekule za proučevanje nekaterih bolezni.
D/ Nekateri izmed naših novih analogov TNF-alfa bodo dodatno prispevali k pojasnitvi vezave TNF na receptor. Mogoče pa bi lahko prispevali k potrditvi novega, doslej še neopisanega mehanizma delovanja.
Pomen za razvoj Slovenije
Predlagani raziskovalni program slovenski farmacevtski industriji odpira možnosti za vstop na področje biotehnološkega pridobivanja lastnih rekombinantnih zdravil. Obenem njej in tudi drugi (npr. prehrambeni) industriji nudi možnosti izkoriščanja izsledkov za uvajanje učinkovitih postopkov izolacije in čiščenja rekombinantnih proteinov na splošno. Program omogoča usposabljanje strokovnjakov iz industrije na področju pridobivanja biotehnološko zanimivih rekombinantnih proteinov - tako v okviru proučevanja naših modelnih molekul kot tudi v okviru možnega sodelovanja pri njihovih specifičnih problematikah. Seveda omogoča tudi kvalitetno usposabljanje mladih raziskovalcev in štipendistov za magisterije oziroma doktorate ter študentov dodiplomskega študija za njihova diplomska dela. V teh ozirih se z novimi znanji lahko poveže z dodiplomskimi študiji biologije in mikrobiologije (na BF v Ljubljani), biokemije (na FKKT) in farmacije (na FF v Ljubljani), kot tudi s fakultetnimi in medfakultetnimi podiplomskimi študiji (predvsem biokemije in molekularne biologije ter biotehnologije) na BF, FFA, FKKT in MF v Ljubljani. Z mednarodnimi povezavami omogoča slovenski znanosti izmenjavo na programskem področju raziskav, slovenski industriji pa dostop do akademskih inštitucij v tujini. Ker je programska skupina obenem tudi osrednja, koordinacijska skupina slovenskega Pridruženega Centra ICGEB (International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology Affiliated Centre), si bomo prizadevali tudi za pridobitev večje udeležbe pri aktivnostih ICGEB. Možnosti vidimo v skupnih mednarodnih bilateralnih oz. multilateralnih raziskovalnih projektih, predvsem pa tudi pri šolanju tujih študentov, ki bi se kot štipendisti ICGEB vključili v podiplomske študijske programe biotehnologije ter biokemije in molekularne biologije na Univerzi v Ljubljani, raziskovalno pa bi sodelovali in se usposabljali pri naših raziskovalnih programih/projektih - v okviru naše programske skupine, pa tudi pri drugih skupinah v Sloveniji. V teh pri merih bi naša skupina kot Pridruženi Center ICGEB imela vlogo koordinatorja oziroma povezovalca programov njihovega usposabljanja.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Zaključno poročilo
