Projekti / Programi
Mehanizmi vnosa DNA pri elektrogenski transpekciji
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 2.06.07 |
Tehnika |
Sistemi in kibernetika |
Biomedicinska tehnika |
| Koda |
Veda |
Področje |
| T115 |
Tehnološke vede |
Medicinska tehnologija |
elektrogenska transfekcija, elektroporacija, celična membrana, DNA
Raziskovalci (18)
Organizacije (2)
Povzetek
Elektroporacija je metoda, ki med drugim omogoča tudi vnos molekul DNA v biološko celico. Visokonapetostni pulzi povzročijo elektroporacijo celične membrane - nastanek por v membrani, ki tako postane začasno prepustna za ione, molekule in makromolekule, ki sicer ne prehajajo čez membrano. Tako imenovana elektrogenska transfekcija je že uveljavljena metoda, kjer se elektroporacija uporablja za vnos genov in vitro in vivo, v zadnjem času pa več raziskav in vivo kaže na to, da bi lahko postala pomembna metoda za vnos DNA pri genski terapiji različnih bolezni kot alternativna metoda virusni transfekciji. Trenutno je večina raziskav usmerjenih v izboljšanje učinkovitosti transfekcije in vivo ter v klinične študije, kljub temu pa mehanizmi vnosa pri elektrogenski transfekciji niso še dovolj znani. Namen predlaganega projekta je na podlagi dosedanjih eksperimentalnih rezultatov in pridobljenih novih rezultatov razložiti mehanizme vnosa DNA preko celične membrane z uporabo električnih pulzov. Eksperimentalno bomo analizirali vpliv različnih parametrov na učinkovitost vnosa DNA za različne protokole na pritrjenih celicah in celicah v suspenziji. Razvili bomo ustrezne teoretične modele prehajanja molekul DNA v celico pri elektrogenski transfekciji ter analizirali, ovrednotili in nadgradili obstoječe modele iz literature. Ustrezno bomo ovrednotili možno razhajanje med rezultati in vitro in podatki iz literature pridobljenimi in vivo. Na podlagi eksperimentalnih podatkov in teoretičnih modelov bomo preizkusili nove protokole za učinkovitejši vnos DNA ter preizkusili možnost nadgraditve obstoječe naprave za elektroporacijo Cliniporator z algoritmom za sprotno optimizacijo napetosti dovedenih električnih pulzov pri elektrogenski transfekciji. boljše razumevanje mehanizmov prehajanja DNA in optimizacija protokolov in še posebej električnih parametrov za elektrogensko transfekcijo.
Pomen za razvoj znanosti
Genska elektrotransfekcija se je v zadnjih letih uveljavila kot nabolj obetavna nevirusna metoda vnosa genov v celice in vitro in in vivo. Najnovejše študije so pokazale, da je tudi idealna metoda za transfekcijo pri genski vakcinaciji, ki ima velik potencial v prihodnosti tudi za zdravljenje raka.
Vendar pa mehanizmi vnosa še niso popolnoma jasni, sam proces elektrotransfekcije pa je težko neposredno opazovati. Glavni namen projekta je bil pojasniti mehanizme pomembne za elektrotransfekcijo na različnih nivojih kompleksnosti of lipidnih mehurčkov, analize elektrotransfekcije in vitro na celičnih linijah do analize in potimizacije parametrov na 3D kolagenskih gelih ter z razvojem numeričnih 3D modelov elektrotransfekcije v tkivih.
Eksperimentalno delo in vitro smo kombinirali z teoretičnim opisom mobilnosti DNA in interakcije z celično membrano. Pridobljeno znanje o mehanizmih pomembnih za elektrotransfekcijo v kombinaciji z numeričnim modeliranjem in optimizacijo v tkivu omogoča optimizacijo protokolov za in vivo elektrogensko terapijo (EGT) in s tem hitrejšo vpeljavo metode v kliniko. Dosedaj so tovrstni modeli obstajali samo za elektrokemoterapijo. Rezultati projekta so podali nova znanstvena spoznanja in so pomembni tudi na mednarodnem nivoju, pridobljena znanja pa lahko tudi omogočajo povezavomed in vitro laboratorijskimi raziskavami in raziskavami na živalih in v klinikah.
Kot eden najpomembnejših rezultatov projekta smo prvi eksperimentalno pokazali, da je elektroforeza ključna za učinkovito gensko elektrotransfekcijo in vivo, kjer je koncentracija plazmidne DNA relativno nizka, medtem ko pri in vitro eksperimentih elektroforeza ni pomembna in zadošča učinkovita elektropermeabilizacija. Prav tako smo pokazali, da je za prenos ugotovitev iz in vitro sistemov v in vivo sisteme potrebno uporabiti suboptimalne koncentracije plazmida v in vitro sistemih oziroma uporabiti in vitro 3D gelski sistem, ki ima podobne lastnosti kot tkivo. Naši rezultati so pomembni tako za razumevanje procesa in mehanizmov genske elektrotransfekcije in vitro in in vivo, kot tudi za izboljšavo eksperimentalnih protokolov.
Eksperimentalne rezultate v okviru projekta smo nadgradili s teoretičnimi izračuni, kar je bilo do sedaj narejeno le v nekaj študijah na tem področju. To je dalo nova spoznanja o poteku genske transfekcije, nova znanja ter možnost razlage ključnih mehanizmov.
Dodatno smo v okviru projekta razvili nov visokonapetostni generator, ki omogoča uporabo različnih kombinacij visoko in nizko napetostnih pulzov z različnimi seti parametrov. Možnost preklopa časovnega zaporedja visoko- in nizko-napetostnih pulzov nam je omogočila specifično študijo vpliva posameznih tipov pulzov ter iz tega pomen elektroforeze, elektropermeabilizacije ter kontakta med DNA in membrano. Izvirne zmožnosti generatorja omogočajo nove eksperimente in so pomembna konkurenčna prednost pred drugimi laboratoriji.
Naši rezultati in ugotovitve so bili do sedaj predstavljeni na več mednarodnih konferencah ter objavljeni v dveh člankih v eni izmed vodilnih revij na področju bioelektrokemije. V pripravi je tudi članek, ki povzema glavne in najnovejše rezultate projekta in bo poslan v eno imed vodilnih revij na področju genske terapije, rezultati pa so zanimivi za raziskovalce, ki načrtujejo in vitro ter in vivo študije elektrogenske transfekcije in genske vakcinacije ter za širše področje bioelektrokemije.
Pomen za razvoj Slovenije
Projekt je interdisciplinaren in pokriva področje tehnike, biomedicine in biotehnologije. Genska elektrotransfekcija je trenutno najbolj obetavna alternativa virusni transfekciji za uporabo v genski terapiji in genski vakcinaciji. V okviru projekta smo prenesli najnovejšo tehnologijo in znanstvena spoznanja na področju genske elektroterapije v slovensko okolje ter uspešno sodelujemo z raziskovalci iz Francije (CNRS, Toulouse). Naša skupina je ena izmed redkih v svetu, ki uspešno povezuje gensko elektrotransfekcijo in vitro na celičnih linijah ter modelske 3D gelske sisteme, eksperimentalne rezultate pa nadgrajujemo z analitično analizo ter numeričnim modeliranjem.
Varovanje zdravja
Elektrogenska transfekcija je obetavna metoda, ki omogoča vnos genetskega materiala z uporabo električnih pulzov (brez uporabe virusnih vektorjev) ter tako omogoča varen vnos DNA. Metoda ima velik potencial za uporabo v okviru genske terapije različnih bolezni (avtoimune, kronične) in prve klinične raziskave so že v teku. Razumevanje in izboljšanje metode elektrogenske transfekcije lahko pripomore k hitrejšemu razvoju in uporabi genske terapije brez uporabe virusnih vektorjev, prav tako pa tudi k izboljšanju že obstoječih protokolov za povečanje učinkovitosti elektrogenske transfekcije.
Prenos novih tehnologij v slovensko omogoča prenos novih tehnologij v klinično testiranje
V okviru projekta smo prenesli najnovejšo tehnologijo in znanstvena spoznanja na področju genske elektrotransfekcije v slovensko okolje ter sami razvili vrsto protokolov. Na podlagi pridobljenega znanja smo vzpostavili sodelovanje s skupino za Molekularno Nevrobiologijo Medicinske Fakultete UL, z možnostjo tudi širšega povezovanja s partnerji znotraj EU pri implementaciji elektrogenske transfekcije v klinično okolje za elektrogensko terapijo in DNA vakcinacijo
Razvoj novih produktov
Razumevanje mehanizmov elektrogenske transfekcije bo omogočalo razvoj novih protokolov za uporabo metode in vitro ter in vivo. To bo skupaj s pridobljenimi eksperimentalnimi izkušnjami vodilo tudi k nadgradnji obstoječih naprav ter razvoju novih naprav za uporabo v biotehnologiji.
V okviru projekta smo razvili tudi novo napravo za generiranje visoko- in nizko-napetostnih pulzov, ki omogoča generiranje poljubnih kombinacij HV in LV pulzov različne dolžine, amplitude, pavz in števila pulzov. Naprava je novost v svetovnem merilu in omogoča sodelovanje z drugimi raziskovalnimi skupinami v Sloveniji in tujini, v pripravi je tudi patentna zaščita.
Prenos naprednih numeričnih metod v biotehnologijo in biomedicino – uspešno smo razvili 3D numrične modele za optimizacijo protokolov genske elektrotransfekcije.
Povezava visokotehnološkega znanja z izobraževalnim sistemom in prenosa v industrijo preko dodiplomskih in podiplomskih predmetov na področju biomedicinske tehnike in biotehnologije. Vodja projekta ter vodji sodelujočih skupin imajo izkušnje z delom v interdisciplinarnih skupinah in so bili mentorji več diplomskih in doktorskim študentom na različnih področjih od elektrotehnike do medicine. Vključenost diplomskih, doktorskih študentov ter podoktorskih raziskovalcev v projekt jim bo omogočila neposreden stik z vrhunskimi biofizikalnimi in biomedicinskimi metodami. Usposabljanje diplomskih in doktorskih študentov za delo na vrhunski tehnologiji ter tesni stiki vodje z industrijo bodo omogočili tudi možnost neposrednega prenosa znanja v industrijo na področju razvoja in aplikacij numeričnega modeliranja ter razvoja in uporabe novih metod in tehnologij.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
