Projekti / Programi
Fosfodiesteraza cikličnih nukleotidov iz Mycobacterium tuberculosis: struktura in funkcija
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.05.00 |
Naravoslovje |
Biokemija in molekularna biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
tuberkuloza, ciklični nukleotidi, fosfodiesteraze, celična signalizacija, kristalna struktura
Raziskovalci (10)
Organizacije (2)
Povzetek
Tretjina svetovnega prebivalstva je okužena z bakterijo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), ki je povzročiteljica tuberkuloze, za katero letno še vedno umre 2 milijona ljudi. Mtb je kot patogen razvila posebne mehanizme, ki jo ščitijo pred gostiteljevim imunskim sistemom. Eden takim mehanizmov je verjetno tudi prenos signalov s pomočjo cikličnih nukleotidov (cAMP/cGMP = cNMP), saj genom Mtb kodira nenavadno veliko število funkcionalnih nukleotidnih ciklaz, ki sintetizirajo cNMP.
Z uporabo bioinformatike, biokemijskih in strukturnih metod smo, skupaj s kolegi iz Indije, pred kratkim identificirali in okarakterizirali gen Rv0805 iz genoma Mtb, ki kodira do sedaj edino poznano cNMP-fosfodiesterazo iz te mikobakterije. Rv0805 je protein, ki spada v razred III cNMP-fosfodiesteraz in razgradi ciklične NMP v nukleotid monofosfate (NMP) s hidrolizo fosfodiesterske vezi, tako in vitro kot in vivo. Rv0805 je homo-dimer. Katalitične domena tega encima ima strukturo, ki je značilna za kalcineurinu-podobne fosfoesteraze. Aktivno mesto Rv0805 vsebuje dva katalitično in strukturno pomembna kovinska iona, Fe3+ in Mn2+.
V tej projektni prijavi predstavljamo naš predlog nadaljevanja raziskav na tem področju z namenom: (a) Določiti kristalno strukturo Rv0805 celotne dolžine; (b) Preučiti katalitično raznolikost Rv0805; (c) Preučevati potencialne interakcije Rv0805 z ostalimi bakterijskimi proteini; (d) Identificirati in okarakterizirati Rv0805 sorodne proteine iz drugih prokariontskih in evkariontskih organizmov.
Cilj naših raziskav je razumeti vlogo cNMP in encimov, ki sodelujejo pri njihovem metabolizmu, v fiziologiji in patologiji mikobakterij. Projekt bomo izvajali v partnerski povezavi z enim vodilnih slovenskih farmacevtskih podjetij, Lek farmacevtska družba d.d. Verjamemo, da bomo s pomočjo komplementarnih znanj in izkušenj raziskovalcev sodelujočih skupin prišli do pomembnih rezultatov tako z znanstvenega vidika, kot z vidika medicinske oziroma farmacevtske uporabe tega znanja.
Pomen za razvoj znanosti
O celičnem signaliziranju preko cikličnih nukleotidov v mikobakterijah je malo znanega, zato to področje predstavlja še precej neraziskano in zato toliko bolj zanimivo raziskovalno nišo. Pred sedmimi leti smo začeli sodelovanje z laboratorijem prof. Sandhye S. Visweswariah z Indian Institute of Science, Bangalore, Indija, ki na tem področju raziskav uspešno deluje že vrsto let. Skupaj z njimi smo prvi na svetu odkrili do sedaj edino znano fosfodiesterazo cikličnih nukelotidov razreda III, Rv0805 iz Mycobacterium tuberculosis. Ti rezultati predstavljajo tudi nasploh prvo podrobno analizo kateregakoli člana Razreda III. Cilj naših raziskav je, da bi dobili čim bolj jasno sliko o procesih v celicah (tako bakterijskih kot tudi evkariontskih), povezanih s celičnim signaliziranjem, kjer sodelujejo ciklični nukleotidi kot sekundarne sporočevalne molekule, tako v normalnih pogojih v celicah, kot tudi v patoloških stanjih. Rezultati raziskav na encimih Razreda III, pridobljeni v obdobju trajanja tega projekta, prispevajo pomemben delež k razvoju razumevanja mehanizma delovanja encimov tega razreda. Še posebej zanimivi so rezultati, ki kažejo na to, kako majhne, toda točno določene spremembe v aminokislinskem zaporedju lahko povzročijo spremembo v substratni specifičnosti med sorodnimi proteini, kar je še posebej pomembno pri primerjanju evolucijsko različnih organizmov ter vlogo teh encimov v njih (npr. mikobakterija nasproti sesalcem). In nenazadnje, da se sam encim Rv0805 nahaja tudi na celični steni mikobakterij, za katero pa vemo, da je eden najpomembnejših struktur za preživetje v gostitelju in nasploh v naravi in je tudi ena izmed tarč usmerjenega iskanja zdravil (antibiotikov). Ravno tako raziskave na sesalskem ortologu encima Rv0805 kažejo na to, kako je narava uporabila določeno ohranjeno zvitje polipeptidnega ogrodja v proteinih ter aminokisline aktivnega centra, da potem ti proteini opravljajo drugačne funkcije v višjih organizmih glede na nižje razvite organizme. Tako je tudi sesalski ortolog Rv0805 je zelo zanimiv tako s znanstvenega kot medicinskega stališča, saj raziskave kažejo, da delecije v človeškem genu za ta protein po vsej verjetnosti povzročajo duševno zaostalost, ki se lahko pokaže že pri novorojenčkih (WAGRov sindrom).
Pomen za razvoj Slovenije
1) Nova znanstvena spoznanja, ki izvirajo iz naših raziskav, prispevajo k boljšemu razumevanju osnovnih bioloških procesov v (patogenih) mikobakterijah, obenem pa tudi pomagajo pri razumevanju podobnosti ali razlik v bioloških procesih v organizmih na drugih evolucijskih stopnjah, ki so pogosto gostitelji teh bakterij. Poznavanje temeljnih zakonitosti delovanja bakterij ter odnosa patogen-gostitelj je zelo pomembno z medicinskega ter farmacevtskega vidika, še posebej v primeru bolezni kot je tuberkuloza, ki v zadnjem času zaradi razvoja novih sevov, odpornih na doslej znane antibiotike, v mnogih primerih postaja spet neozdravljiva bolezen, ki se lahko konča s smrtnim izidom. Ta problem je sicer izrazit v revnih deželah svetovnega Juga in Vzhoda, z gospodarskimi krizami in selitvijo beguncev ter povečevanjem revščine pa se prenaša tudi v razviti svet, zato je ukrepanje, ki temelji tudi na znanstvenih izsledkih, pomembno tudi v Sloveniji. Kot že rečeno v točki 9.1, pa upamo, da bodo tudi naši novi rezultati na podganjem ortologu Rv0805, pomagali k razumevanju kompleksnosti WAGRovega sindroma, ki prizadene zarodke oziroma kasneje novorojenčke, ki imajo delecijo v genu za ta protein. Z našimi raziskavami poskušamo predvsem osvetliti, kako ta protein deluje v normalnih pogojih in kaj bi torej predstavljalo njegovo pomanjkanje.
2) Promocija Slovenije oziroma slovenske znanosti: obisk mednarodnih konferenc (aktivna udeležba v obliki vabljenih predavanj in/ali plakatov), objavljanje člankov v mednarodnih znanstvenih revijah ter sodelovanje s tujimi znanstveniki. Na redne delovne obiske v Slovenijo pa prihaja tudi naša sodelavka iz Indije, Prof. Visweswariah, s katero imamo bilateralni projekt, na delovne obiske k nam prihajajo pa tudi člani njene raziskovalne skupine.
3) Izobraževanje kadrov in odpiranje novih delovnih mest: vodja projekta, Dr. Podobnik sodeluje v izobraževalnem sistemu v Sloveniji, saj je mentorica diplomantom in podiplomskim študentom Univerze v Ljubljani. Na tekočem projektu aktivno sodeluje doktorantka Urška Dermol, dipl. univ. ekol., katere tematika doktorskega dela je direktno povezana s tematiko tekočega projekta. V letu 2009 je pod mentorstvom dr. Podobnik doktorirala Petra Draškovič, iz tematike inozitol pirofosfatov, ki so tudi potencialne sekundarne sporočevalne molekule. Ravno tako je od maja 2009 dr. Podobnik tudi mentorica podoktorantki dr. Katji Rebolj.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2008,
2009,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2008,
2009,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
