Projekti / Programi
Dvojna narava matičnih celic v raku in njihova uporaba v zdravljenju
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.03.00 |
Naravoslovje |
Biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B001 |
Biomedicinske vede |
Splošne biomedicinske vede |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
Bioinformatika (Degradome, Migratom, Metabolomika, Proteomika,Transkriptomika), Glioblastom, Matične celice (mezenhimske, neuralne, tumorske) , Proteaze
Raziskovalci (19)
Organizacije (5)
Povzetek
Glioblastoma multiformae (GBM) je eden najbolj smrtnih oblik raka z mediano preživetja okrog 12 mesecev. Novejše teorije nastanka raka opisujejo nastanek malignega tkiva iz tumor inicirajoče celice, ki ima lastnosti podobne matičnim celicam – to je glioblastomske matične celice (GMC). Selektivno ciljno uničenje teh celic, z uporabo infiltrirajočih mezenhimskih matičnih celic (MMC), predstavlja nov možni način zdravljenja GBM.
Del A: Proteom GMC – PM povezani proteinski označevalci
Za raziskovalno in klinično uporabo nujno potrebujemo nove proteinske označevalce celic GMC s katerimi bo mogoče ločiti med celicami GMC in normalnimi nevralnimi matičnimi celicami (NMC). Ti označevalci bodo uporabni za diagnozo in prognozo preživetja pacientov, hkrati pa bodo lahko služili kot tarče za bolj učinkovito terapijo. Ker zanesljivi označevalci še niso znani, predlagamo uporabo proteomike na izoliranih proteinih iz plazemske membrane (PM) za določitev prstnega odtisa GMC. Natančneje:
1. Naš namen je razkriti PM-proteom z metodo proteomike geLC-MS v sferoidih GBM (tumorosferah), izoliranih iz humanih GBM biopsij, ki so močno obogatene z GMC in jih primerjati s sferoidi NMC (nevrosferami). Testirani sferoidi bodo gojeni v gojišču s serumom in brez seruma.
2. Izraženi proteini tumorosfer, ki se bodo statistično značilno različno izražali v nevrosferah bodo nato validirani na tkivnih mikromrežah (TMA), sestavljenih iz GBM vzorcev bolnikov. S tem bo določena diagnostična in napovedna vrednost novih označevalcev. Najbolj relevantni označevalci bodo testirani s funcijskimi testi in vitro in in vivo.
Del B: Fenotipska karakterizacija GMC
Glavna značilnost GBM tumorjev je njihov infiltrativen tip invazije v okoliško tkivo. Predpostavlja se, da je migratorni fenotip GMC povezan z epitelno-mezenhimsko-preobrazbo (EMP), ki je sicer značilna za epitelijske tumorje. Predvidevamo, da do podobne reverzibilne preobrazbe iz stacionarnega v migratoren (invaziven) fenotip prihaja tudi pri celicah GMC in te spremembe želimo identificirati na ravni transkriptoma-degradoma in jih primerjati s PM-proteomom GMC. Natančneje:
1. Naš namen je primerjati transkriptom tumorosfer GMC s transkriptomom visoko migratornih nevrosfer NMC. »Mirujoč« transkriptom celic bomo primerjali z njihovim »aktiviranim migratornim« transkriptomom (migratomom) po stimulaciji EMP z (a) dodatkom seruma in (b) izpostavitvijo hipoksičnim pogojem, ki vladajov tkivnih nišah GMC.
2. Poseben poudarek bo na migratomu GMC, ki je povezan z degradomom (proteazami), z namenom odkriti signalne poti, ki povezujejo izražanje proteaz s procesom EMP.
3. Novi označevalci GMC (GMC-specifični & EMP-ključni) bodo validirani in funkcijsko potrjeni z utišanjem/izničenjem in biološko/kemično inaktivacijo v invazijskih testih. Posebna pozornost bo namenjena primerjavi s profilom PM-proteaz dobljenih pri analizi PM proteoma GMC(Del A).
Del C: Mikrookolje GMC– infiltracija z MMC
Tumorsko mikrookolje vpliva na EMP/MEP. V mikrookolju GBM najdemo tudi MMC (gbMMC), ki lahko vplivajo na GMC. Interakcije med (KM)MMC iz kostnega mozga, gbMMC in GSC bomo analizirali in vitro in in vivo v živalskem modelu. Naš cilj je odkriti transkriptomski, metabolni in parakrini odziv ko-kultiviranih celic in vitro. Natančneje:
1. Raziskali bomo vpliv ko-kultivacije celic MMC(KM), gbMMC in GMC na njihov metabolni prstni odtis in odpornost na znane citotoksične substance. Predvidevamo, da nam bodo te razlike razkrile pogoje, v katerih nastopi inihibitoren učinek MMC na invazijo celic GMC.
2. Primerjalna analiza transkriptoma, miRNA, citokinov (Deli A, B in C) bo osredotočena na spremembe migratoma in degradoma celic GMC med EMP/MEP, ki jo v Delu C povzroča ko-kultivacija s celicami (gb)MMC.
Učinkovitost interakcij MMC/gbMMC/GMC in vitro bo potrjena in vivo s poskusi i.v. vbrizganja označenih MMC v poskusne živali z GBM ksenografti. Stopnjo pričakovane regresije GBM bomo spremljali z moderno tehniko visok
Pomen za razvoj znanosti
Z različnimi pristopi je moč dobiti povsem nove še neodkrite specifične označevalce različnih tipov celic. Pomemben nov znanstveni pristop, ki smo ga mi ubrali v okviru tega projekta je povezovanje raziskav biologije tumorjev in matičnih celic s sistemsko biologijo. Z analizo izražanja genov, proteinov in regulatornih molekul ob različnih in vitro ustvarjenih pogojih, ki so podobni pogojem v samem tumorju in vivo, je namreč možno dobiti vpogled v biološke lastnosti glioblastomskih (GBM) celic v primerjavi z normalnimi nevralnimi celicami. S povezavo laboratorijskih raziskav na kliničnem materialu in celičnih kulturah (podatki iz t.i. »mokrega« laboratorijskega dela) z bioinformatiko (»suhega« laboratorijskega dela), smo uspeli identificirati nove označevalce za GSC in GBM celice na nivojih proteomike, transkriptomike in citokinskega profiliranja. Odkrite označevalce CD9, TRIM 28, Stefin A in katepsin K smo tudi okarakterizirali, ter in vivo validirali na manjši skupini pacientov, čaka jih še potrditev na večji skupini GBM pacientov za uspešen prenos v kliniko. Uspeli smo dokazati, da je tudi v plazmi bolnika z GBM možna detekcija tako diagnostičnih kot prognostičnih označevalcev in kot takega identificirali GNAO1. Slednji tip diagnostiki ter sledenja razvoja boleznije izrednega pomena za bolnike z GBM, saj serumska diagnostika spada med relativno ne-invazivne metod v primerjavi z odvzemom tumorskih biopsij. Zgoraj navedeni novi identificirani označevalci GSC in GBM utegnejo vplivati na napoved preživetja bolnikov z GBM in njihovo občutljivosti na zdravljenje. Obenem pa predstavljajo tudi nove tarče za razvoj bolj učinkovitih terapij za preprečitev ponovnega razvoja tumorskega obolenja. S sledenjem izražanju genov, proteinov, ter njihovih regulatornih molekul (citokinov, mikroRNA) in metabolnega stanja celic GBM in GSC v različnem okolju, (kot je npr. pomanjkanje kisika -hipoksija), je možno razviti kontrolo njihove invazivnosti, ki je ključna za širjenje GBM v normalno možganovino. Identifikacija genov in proteinov/proteaz, ki se pri reverzibilnem prehodu iz stacionarnega v migratorno stanje aktivirajo v GSC, je ključnega pomena za razumevanje in inhibicijo njihovih invazivnih lastnosti. Dokazali smo, da bi ciljno trajno znižanje aktivnosti CatL, zaradi sinergističnega delovanja znižanja CatL in določenih citotoksičnih učinkovin prišlo v poštev pri kombinirani terapiji možganskih tumorjev s kemoterapevtiki (v našem primeru arzenita). To nam je uspelo dokazati s povečano apoptozo celic GBM tako v 3D modelu U87 sferoida in vivo, kot v primeru organotipskih sferoidov pilocitnega astrocitoma, kjer pa učinek ni bil tako izrazit. V slednjih je namreč vpliv zaščite opazen s strani strome primarnega tumorja iz katerega ti sfeoridi izvirajo. Zaradi tega učinka znižanja CatL na apoptozo povzročeno z arzenitom, smemo ambicionzno predvidevati, da bi se ciljno zniževanje catL v človeškem možganskem tumorju lahko izrazilo v večji selektivni dovzetnosti tumorskih celic na kemoterapijo. Slednje bi omogočilo znižanje uporabljene doze toksičnih kemoterapevtskih učinkovin, zmanjšalo pojav negativnih stranskih učinkov citotoksičnih učinkovin in povečalo kvaliteto življenja rakavih bolnikov. Prav tako se je predpostavljalo, da lahko mezenhimske matične celice, po infiltraciji v GBM iz kostnega mozga, kjer postanejo del GBM mikrookolja (gbMMC) vplivajo na obnašanje celic GBM oz. GSC. S sistemskim pristopom smo sledili interakcijam GBM andGSC in MSC, v direktnih in indirektnih so-kulturah razkrili MCP1/CCL2, DKK1 in BDKRB1 molekularne mehanizme njihove interakcije, pomembna predvsem za uravnavanje invazije celic GBM s potencialom za uporabo v klinični onkologiji kot tarče za zdravljenje GBM.
Pomen za razvoj Slovenije
Izveden projekt je vključeval v medicini tako imenovane translacijske raziskave, ki težijo k prehodu rezultatov iz laboratorija v klinično uporabo za diagnozo in prognozo oz. določanje odziva na zdravljenje in so pomembne predvsem za razvoj novih tarčnih zdravil za bolnike z GBM. Naši rezultati so torej uporabni s treh vidikov: - za nadaljnji razvoj biomarkerjev matičnih celic GBM v onkologiji, ki ji lahko v prihodnosti slede patentne uporabe t.i. diagnostičnih kitov odziva na terapijo. Zelo obetavna, čeprav nekoliko oddaljena klinična aplikacija teh raziskav je možnost zdravljenja GBM z normalnimi neuroepitelijskimi ali mezenhimskimi matičnimi celicami (MSC). Obnašanje normalnih matičnih celic v tumorskem mikro-okolju so ovrednostile že mnoge študije in zanje je znano, da so same ali kot vektorji primerne za vnos zdravil v rakavo (GBM) tkivo. Število biobank, ki hranijo tkiva, obogatena z MSC za njihovo kasnejšo alogeno uporabo narašča in tako donorji kot tudi bolniki sami, pričakujejo in zahtevajo razvoj teh znanj, ki vzbujajo upanje za zdravljenje predvsem težko ali neozdravljivih, rakavih bolezni, kot je GBM. - ker do novih aplikacij na področju matičnih celic prihaja predvsem v manjših biotehnoloških podjetjih, ki razvijajo naprave, reagente in tehnologije, uporabne v raziskavah matičnih celic, je to še posebej dobro za Slovenijo. Predlagani rezultati projekta bodo prispevali k večji mednarodni poslovni prepoznavnosti našega inštituta (NIBa) ter posredno povečali možnosti za vključitev Slovenije v regionalni Evropski biotehnološki trg. Izvedene raziskave je podpiral tudi (na našo pobudo ustanovljen) Center za Matične Celice (glej http://www.nib.si/), ki bo tudi v prihodnje deluval kot prepoznavni posredovalec novih poslovnih zvez, vključno s partnerstvi vzpostavljenimi v okviru mednarodnega Interreg GLIOMA projekta (Center za genetsko inženirstvo in biotehnologije (ICGEB- Area di Recerca, v Padričah, Italija), Univerza v Vidmu in Univerzo v Trstu ter z Onkološkim centrom v Avianu). - tretji vidik se nanaša na izboljšanje razumevanja normalnih matičnih celic kot terapevtskih orodij za “napredne celične terapije”. Izraz je uveljavljen v Uredbi (EC) Št. 1394/2007 Evropskega parlamenta in Sveta o naprednih medicinskih pripomočkih, ki prav tako vključuje celične terapije in tkivno inženirstvo. Napredne celične terapije so nadaljevanje zdravljenja raka s presaditvijo kostnega mozga. Nov način tega pristopa je dovajanje MSC v tumor v kombinaciji z gensko terapijo (n.pr. genetsko spremenjene MSC). V večini razvitih držav so napredne celične terapije že del transplantacij, saj so tehnično in logistično dokaj nezahtevne. V Evropi so klinični poskusi celične terapije z MSC zaradi neustrezne kakovosti in stabilnosti terapevtskih matičnih celic še vedno v začetnih fazah (klinični poskusi I, II, III). V ZDA imajo celične terapije z matičnimi celicami nefarmakološki status in je proces odobritve s strani Administracije za hrano in zdravila (FDA) krajši kot za komercializacijo terapij s kemijskimi in biološkimi zdravili. Število in razpon kliničnih raziskav narašča po celem svetu, zato lahko pričakujemo, da bodo vsaj nekatere teh terapij raka v bližnji prihodnosti uspešne in bodo prišla na trg v naslednjih 5 letih tudi v Sloveniji, Tu pa moramo zaradi zahtevnih tehnologij uporabe pridobiti znanja. Slednje dosegamo s predlaganimi mednarodno vpetimi raziskavami na tem področju, ki tako prispevajo k širši uporabi in biološki varnosti prihodnjih terapij, osnovanih na matičnih celicah.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
