Projekti / Programi
Antiangiogena genska terapija raka: tarčno zdravljenje z uporabo elektroporacije in magnetnih nanodelcev kot dostavnih sistemov
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.04.00 |
Medicina |
Onkologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B200 |
Biomedicinske vede |
Citologija, onkologija, kancerologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
genska terapija, anti-angiogeneza, melanom, sarkom, elektroporacija, elektrogenska terapija, nano tehnologija, magnetofekcija, radioterapija
Raziskovalci (30)
Organizacije (3)
Povzetek
Namen projekta je razvoj novih pristopov genske terapije za zdravljenje malignega melanoma in sarkoma, ki temeljijo na antiangiogenih mehanizmih. Na eksperimentalnih tumorjih bomo preizkusili učinek novih plazmidov z antiangiogenim delovanjem na tumorje z uporabo nevirusnih dostavnih sistemov: elektroporacijo in magnetnimi nanodelci. Za uspešnejšo translacijo v kliniko bomo preizkusili kombinacijo genske terapije z radioterapijo.
Projekt temelji na izdelavi novih plazmidov, ki kodirajo miRNA proti endoglinu (CD105) in adhezijski molekuli celic melanoma (MCAM/CD146), ki sta specifični za endotelijske celice v tumorjih in celice melanoma sposobne invazije. Ti dve specifični tarči bomo uporabili za tretiranje dveh različnih tumorjev melanoma pri eksperimentalnih živalih; melanom B16F1 z nizkim metastatskim potencialom in B16F10 z visokim metastatskim potencialom. Zaradi navzkrižne specifičnosti z ostalimi tipi tumorjev bomo uporabili tudi tumorski model sarkoma SA-1. Uporabili bomo tudi plazmid AMEP, ki ga je pripravil in delno validiral naš industrijski partner. Plazmid AMEP ima tako antiangiogeni kot neposredni citotoksični učinek na celice in tumorje melanoma.
Za vnos plazmidov bomo uporabili nevirusne dostavne sisteme; elektroporacijo in magnetne nanodelce. Elektroporacija je uveljavljena metoda za vnos genov za transfekcijo tumorjev, mišice in kože (elektrogenska terapija). Vnos genov z magnetnimi nanodelci (magnetofekcija) je v svoji začetni razvojni fazi. Ta pristop razvijamo v naši raziskovalni skupini z namenom testiranja in implementacije na področju zdravljenja raka.
Z elektrogensko terapijo in magnetofekcijo bomo določili učinkovitost transfekcije plazmidov, ki jih bomo pripravili in plazmida AMEP v celicah in vitro, ter njihov učinek na proliferacijo, adhezijo in invazijo celic. Antiangiogeni potencial plazmidov bomo testirali in vitro s testom angiogeneze (tube formation assay). Na podlagi teh rezultatov bomo nadaljevali s proučevanjem antiangiogenih in protitumorskih učinkov z intravitalno mikroskopijo na modelu dorzalnega okna. S pridobljenimi podatki bomo določili antiangiogeno učinkovitost narejenih plazmidov, ki kodirajo molekule miRNA, ter njihovo protitumorsko učinkovitost na tumorskih modelih melanoma in sarkoma in vivo.
Na induciranih tumorjih in metastazah bomo in vivo testirali protitumorsko učinkovitost plazmidov, ki kodirajo miRNA proti CD105 in CD146 in plazmida AMEP. Z uporabo intratumorske elektrogenske terapije ali magnetofekcije bomo testirali neposredne učinke na izbranih tumorskih modelih. Predvidena je tudi intramuskularna transfekcija plazmida AMEP, s katero bomo določili raven sistemskega sproščanja proteina v obtoku in njegove učinke na lokalno rast tumorjev in metastaz. Uporabili bomo obe metodi transfekcije; elektrogensko terapijo in magnetofekcijo. Ti eksperimenti predstavljajo izhodišče za nadaljnje eksperimente v kombinaciji z radioterapijo.
Antiangiogene terapije so že v uporabi v kombinaciji z radioterapijo za zdravljenje raka, vendar je antiangiogena genska terapija kot radiosenzitirajoča terapija še vedno v začetni fazi razvoja. Zato bomo elektrogensko terapijo s plazmidi, kot adjuvantno terapijo, kombinirali z radioterapijo. Določili bomo najboljše kombinacije terapij bodisi z enkratno bodisi večkratno gensko terapijo v kombinaciji z enkratno dozo obsevanja ali frakcioniranim obsevanjem. Raziskave bomo v največji meri izvajali na tumorskem modelu melanoma.
Z rezultati bomo pridobili podatke o protitumorski učinkovitosti plazmidov, ki kodirajo miRNA proti CD105 ali CD146 in plazmida AMEP na tumorje melanoma in sarkoma. Ravno tako bomo določili njihovo protitumorsko učinkovitost v kombinaciji z radioterapijo, kar bo osnova za translacijo pridobljenega znanja v kliniko.
Pomen za razvoj znanosti
Večina antiangiogenih terapij, ki se uporabljajo v klinični praksi, temelji na zaviranju signalnih poti vaskularnega endotelnega rastnega faktorja. S tovrstnimi terapijami so povezani hudi neželeni učinki ter neobčutljivost določenih vrst tumorjev. Zato se iščejo nove tarče, ki bi bile neodvisne od vaskularnega endotelnega rastnega faktorja. Tako smo se v projektu osredotočili na tri nove tarčne molekule, in sicer endoglin (CD105), celično adhezijsko molekulo melanoma (CD146/MCAM) in integrine. Endoglin je koreceptor transformirajočega rastnega faktorja ? in se izraža zelo specifično samo v aktiviranih tumorskih endotelnih celicah, zato predstavlja potencialno in izredno primerno tarčo, saj aktivira endotelne celice po signalni poti, ki je neodvisna od endotelnega rastnega faktorja. Molekula CD146 ima pomembno vlogo pri razvoju melanoma in njegovem napredovanju, vključno z invazijo, metastatskim potencialom ter angiogenezo, zato predstavlja potencialno tarčo pri genski terapiji melanoma, katerega incidenčna in umrljivostna stopnja se povečujeta. Z vezavo proteina AMEP na tarčna integrina ?5ßI, ki se izraža na melanomskih celicah, in ?VßIII, ki se izraža na aktiviranih endotelnih celicah, bi zavrli njuno delovanje in tako povzročili protitumorski in antiangiogeni učinek. Za ciljanje CD105 in CD146 smo uporabili nov pristop v molekularni biologiji, in sicer RNA interferenco. Pripravili smo povsem novi plazmidni DNA, eno ki kodira shRNA proti CD105 in drugo ki kodira shRNA proti CD146. Integrine pa smo ciljali s proteinom AMEP, ki ga je kodiral plazmid AMEP. Kar se večina kliničnih študij genske terapije poslužuje virusnih dostavnih sistemov, smo se v projektu zaradi varnosti odločili za razvoj nevirusnih. Za vnos plazmidov v celice in tumorje smo uporabili elektroporacijo, ki je že razvita in optimizirana metoda, in magnetokefcijo, ki še ni tako razivita metoda. Tako smo testirali antiangiogeni in protitumorski učinek na celičnih kulturah in tumorskih modelih po genskem elektroprenosu in magnetofekciji s plazmidi, ki so specifični za tri nove tarče. Pokazali smo, da so terapije izvedljive, učinkovite, specifične in brez neželenih učinkov. Rezultati raziskav v okviru projekta predstavljajo doprinos k uveljavitvi antiangiogene genske terapije, ki bi lahko bila v prihodnosti uporabljena v kombinaciji z radioterapijo ali standardnimi citotoksičnimi zdravljenji raka, saj bi zavirala rast tumorjev in razvoj malignega fenotipa. Doprinesli smo tudi k razvoju magnetofekcije, saj se je v in vivo poskusih izkazala kot učinkovita, neinvazivna in neboleča nevirusna metoda vnosa genskega materiala v tumorje, in ima zagotovo visok potencial za nadaljnje študije in prenos v klinično prakso. Z uporabo novejše molekularno biološke tehnike, t.i. interferenčne siRNA tehnologije, ki uravnava izražanje genov na post-transkripcijski ravni za mRNA, smo doprinesli k njeni izboljšavi in k morebitni prihodnji dopolnitvi pristopov genske terapije. Vse tri raziskovane molekule, CD105, CD146 in integrini, so se izkazale za potencialne tarče, proti katerim je smiselno še naprej razvijati ciljane terapije.
Pomen za razvoj Slovenije
Razvoj antiangiogene genske terapije je relativno nov in še ne popolnoma razvit pristop zdravljenja raka tako v svetu kot tudi v Sloveniji. Raziskava na novih tarčah za antiangiogeno terapijo je bila nujna, saj imajo dosedanje uveljavljene antiangiogene terapije veliko neželenih stranskih učinkov, zato so nove tarče, ki bi delovale po drugih signalnih poteh, potrebne. Raziskave na področju genskga elektroprenosa in magnetofekcije so tako doprinesle k razvoj tudi drugih pristopov, ki temeljijo na nevirusnem prenosu genov v tarčne celice in tumorje. Z optimizacijo in uporabo magnetofekcije v raziskavi, pa smo doprinesli nova znanja relativno mlademu področju biomedicinske nanotehnologije, kar je pomembno ne le za Slovenijo, temveč tudi v svetovnem merilu. V projekt so bili vključeni mladi raziskovalci iz Univerze v Ljubljani, ki so spoznavali in se učili novih pristopov genske terapije raka, bazičnega znanja na tem področju, priprave in gojenja ter izolacije plazmidov, različnih testov na celičnih kulturah in tumorskih modelih za določanje protitumorskega in antiangiogenega učinka, ter določanja mehanizmov delovanja terapij.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
