Projekti / Programi
Preučevanje hom(e)olognih rekombinacij v evoluciji poliketidnih sintaz
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.01 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
Tehnologija rekombinantne DNA |
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.09 |
Tehniške in tehnološke vede |
Industrijska biotehnologija |
Streptomicete, rekombinacije, poliketid sintaze, hiper-rekombinacijski sevi
Raziskovalci (22)
Organizacije (3)
Povzetek
Aktinomicete so po gramu pozitivne bakterije, ki so komercialno zelo pomembni mikroorganizmi, saj proizvajajo daleč največje število industrijsko in klinično pomembnih naravnih bioaktivnih produktov, ki so trenutno v uporabi. Ena od najpomembnejših skupin takšnih naravnih produktov, ki so v široki klinični uporabi, so poliketidne spojine s protibakterijskimi (makrolidi), protitumorskimi (antraciklini, epotilon, rapamicin) in imunosupresorskimi (FK506) lastnostmi. Mnoge izmed teh poliketidnih spojin so sintetizirane na velikih in kompleksnih multiencimski sistemih imenovanih modularne poliketid sintaze tipa I (PKS). Z namenom ustvarjanja novih analogov zdravil so za manipulacijo teh biosinteznih genskih skupin PKS uporabili različne biosintezne pristope. Večina teh pristopov temelji na procesu hom(e)ologne rekombinacije (HR). Čeprav je ta pristop v določenih primerih uspešen, se je velikokrat izkazal kot zelo zahteven in zamuden zaradi običajno nizke frekvence HR pri aktinomicetnih (streptomicetnih) sevih, ki so producenti teh sekundarnih metabolitov. Na splošno še vedno slabo razumemo mehanizme rekombinacije pri teh mikroorganizmih, kar posledično zelo omejuje možnosti za gensko manipulacijo aktinomicetnih encimskih mehanizmov HR. Nedavna odkritja, do katerih so prišli s komparativnimi študijami številnih zaporedij aktinomicetnih genomov, katerih število se hitro povečuje, so pokazala obstoj novih genov, ki kodirajo encime, domnevno vpletene v različne rekombinacijske poti. Predvsem odkritje predhodno nepoznanega aktinomicetnega homologa evkariotskega rekombinacijskega proteina Ku, vpletenega v popravljanje dvojnega zloma DNA z nehomolognim združevanjem koncev (non-homologous end joining – NHEJ), je sprožilo domneve, da je učinkovitost HR zavrta s strani te poti. Uspešna konstrukcija streptomicetnih sevov z inaktiviranim genom recA, za katerega se je domnevalo, da je nujen za preživetje celic, je odprla pot novim možnostim za potencialno izboljšanje mehanizmov HR v teh organizmih. Na podlagi teh ugotovitev, je glavni namen predlaganega projekta preučiti možne načine izboljšanja frekvence HR, bodisi z inaktivacijo genov, ki kodirajo encimsko aktivnost, ki zavira procese HR ali pa z zamenjavo obstoječih mehanizmov HR z njihovimi ortologi iz drugih organizmov z znano visoko učinkovitostjo HR. Ta študija bi lahko močno izboljšala naše znanje o HR pri aktinomicetah na splošno in istočasno vodila v razvoj hiper-rekombinacijskih (hyper-rec) aktinomicetnih (streptomicetnih) sevov, kar je pogoj za bolj učinkovito in vsestransko manipulacijo genskih skupin PKS. Na ta način bi lahko lažje uporabili rekombiniringu-podobne tehnike za modifikacijo izbranih PKS modulov direktno v gostiteljskih aktinomicetnih (streptomicetnih) sevih. Takšen pristop bi predstavljal velik napredek pri iskanju novih rešitev za učinkovito manipulacijo teh kompleksnih in za manipulacijo zahtevnih genskih skupin PKS in pri proizvodnji novih poliketidnih spojin. Če vzamemo vse to v poštev, lahko trdimo, da bi pričakovani rezultati predlaganega projekta močno povečali učinkovitost metod biosinteznega inženiringa, kot tudi dela na področju sintezne biologije na splošno. Po eni strani ta projekt vodi v močno akademsko usmerjeno in intenzivno študijo nenavadnih rekombinacijskih procesov pri aktinomicetah. Po drugi strani pa bi ugotovitve tega raziskovanja lahko vodile v konkreten razvoj novih bioaktivnih spojin in potencialnih kandidatov za zdravila in tudi prispevale k širšemu področju biosinteznega inženiringa in pristopom sintezne biologije, ki se uporabljajo pri odkrivanju zdravil s strani akademskih skupin in industije po celem svetu.
Pomen za razvoj znanosti
Primarni cilj tega projekta je bil bolje preučiti mehanizme genetske rekombinacije pri aktinomicetah, ki so slabo poznani in drugačni od večine poznanih bakterijskih rekombinacijskih in popravljalnih sistemov. Glede na življenjski cikel bakterij iz skupine aktinomicet in njihovega naravnega okolja ni tako nepričakovano, da so te vrste razvile različen rekombinacijski in DNA popravljalni sistem v primerjavi z ostalimi proteobakterijami. V tem projektu smo se osredotočili na sev S. rapamycinicus, ki proizvaja industrijsko pomemben imunosupresiv rapamicin, kjer smo podrobno preučili minimalni segment učinkovitega procesiranja (MEPS) in vlogo nekaterih rekombinacijskih genov. Tako pridobljeni podatki so nam bili v pomoč pri pripravi specifičnih genskih konstruktov za manipulacijo genske skupine za biosintezo rapamicina in pripravi gensko spremenjenih sevov S. rapamycinicus, ki proizvajajo nove analoge. Boljše razumevanje rekombinacijskih procesov bo imelo tudi doprinos področju biosinteznega inženiringa in aplikacij sintezne biologije v aktinomicetah, omogočilo pa bo tudi učinkovitejše manipulacije industrijskih in medicinsko pomembnih aktinomicet za proizvodnjo novih bioaktivnih spojin. V tem projektu smo preučevali zelo bazično biološko vprašanje tega edinstvenega rekombinacijskega mehanizma, ki so nam prinesli nova spoznanja in orodja s katerimi smo lahko razvili nove učinkovine s pomočjo t.i. sintezne biologije oziroma kombinatornega biosinteznega inženiringa.
Pomen za razvoj Slovenije
Aktinomicete so industrijsko pomemben vir biološko aktivnih spojin, ki se uporabljajo v današnji medicini. Desetletja dolgi intenzivni programi odkrivanja novih učinkovin, ki so jih izvajale velike farmacevtske družbe, so te naravne vire bioaktivnih spojin že močno izčrpale, v veliki meri pa so izčrpani tudi pristopi pol-sintezne kemije za derivatizacijo naravnih/izoliranih spojin za razvoj novih analogov. Pristopa, kot sta sintezna biologija in biosintezni inženiring, predstavljata velik potencial za razvoj novih spojin. Vendar pa je ravno biosintezne genske skupine, ki vsebujejo gene za poliketid sintaze in ki za tovrstne pristope predstavljajo še največji potencial, izredno težko gensko manipulirati. Izboljšano razumevanje rekombinacijskih mehanizmov teh biosinteznih genskih skupin je zato ključnega pomena za razvoj novih učinkovin inje pripeljalo do razvoja novih analogov bioaktivnih spojin že tekom tega projekta. Tako so pridobljeni rezultati projekta neposredno uporabni za prijavitelja, biotehnološko podjetje Acies Bio. Ena izmed pomembnejših aktivnosti podjetja Acies Bio je razvoj novih bioaktivnih spojin s pomočjo biosinteznih in pol-sinteznih pristopov. Širša uporaba spoznanj in mehanizmov, pridobljenih tekom projekta, pa bo koristila tudi pri razvoju izboljšanih tehnologij za proizvodnjo sekundarnih metabolitov, ki jih Acies Bio razvija za domača in tuja farmacevtska podjetja. Izvedba projekta je potekala v biotehnološkem razvojno-raziskovalnem podjetju Acies Bio, na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani in Institutu Jožef Stefan ter drugimi mednarodnimi akademskimi partnerji. Tovrstno sodelovanje med akademijo in industrijo spodbuja izmenjavo izkušenj, znanja in dobre prakse, kar pa je izjemnega pomena za povečanje konkurenčnosti slovenske znanosti kot tudi podjetij. Sodelovanje na tem projektu je tako vključevalo tako domače kot tudi tuje raziskovalce in strokovnjake. Pridobljeno znanje tekom projekta pa se bo prenašalo tudi na študente univerzitetnih programov biotehnologije in mikrobiologije Biotehniške fakultete ter študente Instituta Jožef Stefan.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
