Projekti / Programi
Genska elektrotransfekcija mišice - od analize na posameznih celicah do numerične optimizacije parametrov v tkivu
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.00 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B001 |
Biomedicinske vede |
Splošne biomedicinske vede |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.04 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Medicinska biotehnologija |
genska terapija, skeletna mišica, numerično modeliranje, elektrotransfekcija, mikroskopija
Raziskovalci (20)
Organizacije (3)
Povzetek
V zadnjih desetletjih je genska transfekcija z elektroporacijo postala ena najbolj obetavnih metod za nevirusni vnos genskega materiala za gensko terapijo in v zadnjem času tudi za DNA vakcinacijo. Lokalno dovedeni električni pulzi povečajo prepustnost membrane in omogočijo prenos plazmidne DNA (pDNA) ali kratkih RNA v celice. Vendar pa trenutno ne obstaja celovit opis mehanizma vnosa genov na molekularnem nivoju. Čeprav lahko vnašamo gene v različna tkiva, pa se je skeletna mišica pokazala kot idealno tarčno tkivo za vnos genov, saj je mišično tkivo enostavno dostopno, predstavlja velik delež telesa, ter omogoča dolgotrajno izražanje genov.
Trenutno je ena glavnih ovir za učinkovito uprabo in vivo EGT v kliničnem okolju še vedno relativno nizka učinkovitost zaradi slabe mobilnosti pDNA znotraj medceličnega prostora. Medtem ko imajo študije v celičnih kulturah zelo kontrolirane pogoje, pa mobilnost pDNA ni ovirana ter je zato rezultate in zaključke težko prenesti na nivo tkiva. Nasprotno pa je in vivo okolje slabo nadzorovano ter je zato analizirati mehanizme vnosa z električnimi pulzi. Tako predstavlja razvoj in vitro 3D gelskih modelov tkiva pomemben korak med in vitro ter in vivo študijami.
Prav tako je bilo dosedaj zelo malo študij izvedenih na primarnih mišičnih celicah, čeprav je mišično tkivo znano kot idealno za gensko elektrofekcijo, saj omogoča učinkovito ter dolgotrajno stabilno izražanje genov. Poleg tega tudi procesi, ki prispevajo k učinkovitemu in dolgotrajnemu izražanju genov v mišičnih celicah niso dobro poznani.
Nadaljni pomembni korak za prenos metode za klinično zdravljenje ljudi je “scale up” in vivo raziskav iz malih živali na ljudi. Navkljub velikemu številu in vivo študij na živalih, so parametri vedno določeni šele po obsežnem eksperimentih. Več ključnih člankov na temo in vivo genske elektrotransfekcije je izpostavilo potrebo po bolj sistematični optimizaciji elektroporacijskega protokola, kar je ključen korak do bolj učinkovite elektrogenske terapije, prenos metode na ljudi, ter hitrejši prehod v klinično uporabo. Zato je za uspešno uporabo genske elektrofekcije v biomedicini pomemben korak razvoj naprednih numeričnih modelov za optimizacijo parametrov elektroporacije.
Eden izmed zanimivih problemov je tudi vnos kratkih molekul RNKi z elektrotransfekcijo, saj je bilo pokazano, da imajo kratke RNKi pomembno vlogo v regulaciji izražanja genov in lahko njihova uporaba vodi do novih terapij. Pri genski elektrotransfekciji je bila do sedaj siRNK uporabljena večinoma za utišanje transgenov, obstaja pa tudi samo ena študija, kjer je bila vnešena miRNK.
Cilji predlaganega projekta so teoretično in eksperimentalno analizirati mobilnost plazmidne DNA in učinkovitost elektrotransfekcije v 3D kolagenskih modelih z vgrajenimi celicami; analiza in optimizacija genske elektrotransfekcije na primarnih humanih mišičnih celicah; raziskati pomen satelitskih celic za dolgotrajno izražanje vnešene pDNA; analiza in vizualizacija korakov elektrotransfekcije; določitev optimalnih parametrov za vnos siRNA in miRNA v primarne mioblaste; ter razvoj 3D numeričnih modelov skeletne mišice za optimizacijo položaja elektrod in električnih parametrov za bolj učinkovito in vivo gensko elektrofekcijo.
Naš namen je integracija teoretične analize z eksperimentalnimi opazovanji na vseh nivojih kompleksnosti od posamezne celice do analize efektivnih lastnosti mišičnega tkiva. Naša eksperimentalna analiza različnih ključnih korakov genske elektrotransfekcije skupaj s teoretičnim opisom procesa ter numeričnim modeliranjem bo omogočila izboljšano kvantifikacijo ter optimizacijo genske elektrotransfekcije v in vitro ter in vivo pogojih.
Pomen za razvoj znanosti
Pridobljeno znanje in analiza mehanizmov vpletenih v ključne korake genske elektrotransfekcije skupaj s teoretičnim opisom procesov je dala nova spoznanja na področju genske elektrotransfekcije. To omogoča bolje razumevanje procesov ter posledično hitrejšo optimizacijo genske elektrotransfekcije za in vitro in ex vivo razmere. Eksperimentalna in teoretična analiza sega od vizualizacije posamezne celice mioblasta, analize elektrotransfekcije ter znotrajceličnega transporta v mišičnih cevčicah, do optimizacije učinkovitosti elektrotransfekcije z uporabo 3D numeričnimi modeli tkiva skeletne mišice. Vzporedno smo zasnovali široko študijo vseh korakov elektrotransfekcije na CHO celicah. V zadnjih letih so bile identificirane različne siRNA in miRNA kot zelo obetavne tarče za uravnavanje izražanja genov ter zdravljenje različnih bolezni. Uspešno smo optimizirali vnos siRNK kot testno molekulo za optimizacijo in vitro pogojev elektrofekcije za kratke oligonukleotide na primarnih humanih mioblastih – vzporedno pa smo analizirali tudi relevantne mehanizme ter izvedli primerjavo s procesi pri elektrotransfekciji pDNA. Nadalje smo razvili smo prvi "multiscale model" elektroporacije tkiva – kjer smo dinamično rešitev za vsiljeno transmembransko napetost in permabilizacije na posamezni celici preko 3D numeričnega modela sklopili s sistemov več celic, tako da lahko opazujemo efektivne lastnosti – kot je efektivna prevodnost, delež permabiliziranih celic in časovna dinamika na bolj realnem »tkivnem« modelu. Vzporedno smo nadgradili obstoječi 3D numerični model, ki omogoča analizo in optimizacijo položaja elekrod ter vizualizacijo porazdelitve električnega polja in toka v skeletni mišici . Poleg znanstvenih spoznanj so tudi pridobljene metodološke veščine (zasnova elektrod, primerjava različnih metod kvantifikacije transfekcije, avtomastka anailza mikroskopskih slik) zanimive širše za znastvenike, ki uporabljajo tehnike transfekcije na širokem področju biotehnologije in biomedicine. Razumevanje procesov, ki so pomembni za uspešno gensko elektrofekcijo, so vodili k izboljšavi obstoječih protokolov in s tem učinkovitosti genske elektrotransfekcije kar lahko pripomore k hitrejšemu razvoju in uporabi brezvirusne elektrogenske terapije v biomedicinskih aplikacijah. Pridobljeno eksperimentalno znanje na in vitro 3D gelskih modelih ter razviti teoretično modeli elektromobilnosti DNA pripomore k razumevanju mehanizmov ter optimizaciji protokolov v razmerah podobnih v tkivu. Uporaba naprednih numeričnih modelov za optimizacijo električnih parametrov in konfiguracij elektrod ter analiza segrevanja lahko pripomore k nadaljnemu napredku na področju genske elektrotransfekcije in vivo. Specifično lahko razviti modeli v sodelovanju s skupinami, ki izvajajo in vivo ter klinične raziskave omogoča izboljšave učinkovitosti genskega vnosa v mišično tkivo ter potencialno k zmanjšanju števila žrtvovanih živali pri določanju optimalnih parametrov. Rezultati so lahko pomembni za raziskovalce, ki se ukvarjajo z elektrogensko terapijo in elektrogensko vakcinacijo v predkliničnih raziskavah.
Pomen za razvoj Slovenije
Vodja projekta je tekom projekta vzpostavila široke povezave z več raziskovalnimi skupinami v Sloveniji s komplemetarno ekspertizo: Laboratorij za biotehnologijo KI, Inštitutom za biologijo celice MF-UL, Laboratorijem za molekularno biologijo MF-UL ter z Odsekom za biotehnologijo IJS. To omogoča učinkovit prenos metodološkega znanja in eskpertiz med skupinami v Sloveniji. Projekt je omogočil prenos novih tehnologij na področju biotehnologije in medicine v slovensko okolje. PI in člani skupine so vodili razvoj tehnik (protokoli vnosa, elektrode, visoko-napetostni generator) ter njihovo implementacijo pri aplikacijah genske elektrotransfekcije za vnos DNA in kratkoverižni RNA moleku, kar omogoča vnos in utišanje genov in vitro (normalne celice, rakaste celice) ter v tkivnih rezinah ex vivo. Prenos naprednih numeričnih metod v biomedicino: pridobljena eksperiza in široko poznavanje metod numeričnega modeliranja, je pripomoglo k prenosu teh znanj tudi na področje EGT za gensko terapijo. Na osnovi 3D numeričnih modelov za EGT smo vzpostavili sodelovanje z vodilnim centrom v Evropi za translacijo elektrogenske terapije v kliniko za zdravljenje raka (Department of experimental Oncology Herlev Hospital, Copenhagen). Možnost širšega povezovanja s partnerji znotraj EU pri implementaciji elektrogenske transfekcije v biotehnoloških in biomedicinskih aplikacijah kot sta elektrogensko terapijo in DNA vakcinacija –vključitev v prijavno vlogo BIOENECA COST konzorcija, ki povezuje skupine iz področja nevrodegenrativnih bolezni, biomedicine in matičnih celic. Povezava visokotehnološkega znanja z izobraževalnim sistemom je bila izvedena preko dodiplomskih in podiplomskih predmetov na področju biomedicine ter vključitvijo več mlajših razsikovalcev projekt. PI ter vodji sodelujočih skupin imajo izkušnje z delom v interdisciplinarnih skupinah in so bili mentorji več diplomskih in doktorskim študentom na različnih področjih od elektrotehnike do biokemije medicine. Vključenost več diplomskih ter doktorskih študentov ter podoktorskih raziskovalcev v projekt je omogočila neposreden stik z vrhunskimi biotehnološkimi in biomedicinskimi metodami. Usposabljanje diplomskih in doktorskih študentov za delo na vrhunski tehnologiji ter tesni stiki PI z več skupinami in industrijo so omogočili tudi možnost neposrednega prenosa znanja v industrijo na področju razvoja in aplikacij numeričnega modeliranja, ter razvoja in uporabe novih metod in tehnologij. PI je na začetku projekta ustanovila interdisciplinarno skupino, ki je trenutno sestavljena iz raziskovalcev iz področij fizike, biologije, biotehnologije in biokemije. Predlagani projekt je omogočil konsolidacijo mlade raziskovalne skupine . V izobraževanje mlajših raziskovalcev je vključeno tudi obiskovanje vrhunskih laboratorijev v svetu, kar je pomembno za dostopanje do tujih znanj obenem pa tudi osnova za izvedbo visoko kvalitetnih raziskav v Sloveniji. Varovanje zdravja: uspešno smo razvili protokol za učinkovit vnos plazmidne DNA v eksplante mišjih hrbtenjač v sodelovanju z dr. Borisom Rogljem, znan.svet iz IJS, ki je tudi vodja projketa “Patogeni mehanizem podaljšanih heksanukleotidnih ponovitev v genu C9orf72 pri nevrodegeneraciji”. Projekt je povezan z povezan z amiotrofična lateralno sklerozo (ALS) in frontotemporalno lobarno degeneracijo (FTLD), obe pa predstavljata dve kompleksne in neozdravljive nevrodegenerativne bolezni. Projekt je zastavljen okoli vprašanja, kaj povzroča agregacijo normalnega TDP-43 pri ALS in FTLD, ter kakšna je vloga okvarjenega RNA metabolizma pri teh boleznih
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
