Projekti / Programi
Inovativni proizvodni sistemi za cepiva in regenerativno medicino
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.00 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.09 |
Tehniške in tehnološke vede |
Industrijska biotehnologija |
čiščenje, celice, VLP, bakteriofagi, nosilci, monoliti, kromatografija
Raziskovalci (20)
Organizacije (5)
Povzetek
V zadnjem desetletju smo priča naglemu razvoju na različnih področjih farmacije in biotehnologije. Za zdravljenje težkih bolezni se vse bolj uporabljajo t.i. biološka zdravila, ki pretežno temeljijo na monoklonskih protitelesih. Poleg njih se raziskuje tudi mnoge druge načine zdravljenja, še posebej na področju cepiv, rezistence na antibiotike, genske in celične terapije in regenerativne medicine. Na področju cepiv se v zadnjem času intenzivno preučujejo virusom podobni delci (ang. Virus Like Particles ali krajše VLP). Nekoliko manj preučevani na področju vakcin so bakteriofagi, ki pa so izredno zanimivi kot alternativa antibiotikom. Poleg tega so v zadnjem času intenzivni predmet študija tudi matične celice za uporabo v tkivnem inženirstvu, celičnih terapijah ter regenerativni medicini.
Čeprav izolacija VLP-jev, bakteriofagov in celic na laboratorijskem nivoju ni problematična, pa je učinkovitost industrijskih procesov za pripravo velikih količin visoko čistega produkta slaba. Za ločbo in čiščenje matičnih celic se v praksi danes uporablja predvsem pretočna citometrija (FACS) in imunomagnetno ločevanje (MACS), ki pa sta predragi za uporabo na industrijskem nivoju. Pri gojenju VLPjev in bakteriofagov je pomembno, da izberemo ustrezen ekspresijski sistem, ki omogoča visoko produktivnost poleg tega pa je potrebno tudi razviti načine čiščenja na industrijskem nivoju, ki bodo imeli visoko produktivnost. Čeprav tradicionalne metode, kot so filtracija in centrifugacija, omogočajo pripravo velikih količin, pa z njimi težko dosegamo zahtevano stopnjo čistosti. Zato se v zadnjem času intenzivno preučuje uporaba kromatografije.
Testiranje celic bomo izvajali z ustrezno celično linijo, ki bo dovolj robustna. VLP-je bomo gojili v rastlinah, s ciljem doseganja zadostne količine, odločili pa smo se za norovirusne VLPje, saj je ta virus glavni povzročitelj nebakterijskega gastroenteritisa. Tudi na izbor bakteriofagov je vplivala njihova uporabnost, saj smo izbrali bakteriofage, ki napadajo bakterije rodu Campylobacter, katera povzroča 400–500 milijonov okužb s hrano letno ter rodu Erwinia in Acidovorax, ki povzročajo velike izgube pri pridelavi živil rastlinskega izvora in okrasnih rastlin. Pri bakteriofagih se bomo v okviru projekta posvetili tudi optimizaciji pogojev gojenja, saj le-ti znatno doprinesejo k pridobljeni količini fagov. Šlo bo predvsem za izbor bakterijskega sistema, pogoje gojenja v bioreaktorju, določitev optimalnega trenutka infekcije ter zaključka procesa.
Težišče raziskav bo potekalo na pripravi ustreznih konvektivnih nosilcev, ki bodo omogočali učinkovito kromatografsko čiščenje celic, VLP-jev in bakteriofagov. En pristop bo optimizacija obstoječih metakrilatnih monolitov na velikost por in vrsto liganda. Predvsem bomo optimirali dolžino graftiranih ročic in njihovo gostoto s ciljem doseganja čim večje propustnosti, vezne kapacitete in izkoristka. V tem sklopu bomo tudi poskusili razviti fraktalne kromatografske nosilce, ki bi po teoretičnih napovedih, morali imeti še boljše lastnosti od obstoječih. Tudi za čiščenje celic bomo razvili nove vrste nosilcev temelečih na anorganskih poroznih nosilcih, votlih vlaknih in makroporoznih kromatografskih monolitih. Vzporedno s pripravo ustrezne strukture nosilca bo velik poudarek na kemijski obdelavi površine, saj je znano, da je glavni problem pri čiščenju celic njihova desorpcija. Da bi poskušali ta problem rešiti, bomo razvili različne tipe ligandov, ki se bodo cepili pod vplivom spremembe mobilne faze ali spremenili svojo konfiguracijo. Gre za različne termoodzivne ligande, ki bi lahko ob spremembi temperature povzročili desorpcijo celic.
Tako pripravljene konvektivne nosilce bomo testirali na celicah, VLP sistemu norovirusa ter na različnih bakteriofagnih sistemih. V drugem delu projekta bo potekala optimizacija nosilcev in postopkov izolacije s ciljem doseganja čim večje učinkovitosti pridobivanja ciljnega produkta.
Pomen za razvoj znanosti
Rezultati projekta so doprinesli k boljšemu razumevanju adsorpcijskih mehanizmov in karakterizacije konvektivnih monolitnih kromatografskih nosilcev, kot tudi različne nove postopke funkcionalizacije. Graftirani metakrilatni monoliti z različnimi funkcionalnimi skupinami prisotnimi na istem nosilcu so omogočili vpogled v kompleksne transportne procese, pogojene s površinsko difuzijo, protitočno difuzijo, entropično stabilizacijo nizkomolekularnih snovi znotraj graftiranih slojev ter sterično izklučitvijo, ponovno kot posledico graftiranih slojev. Prav tako se je izkazalo, da je aktivnost skupin znotraj graftiranega sloja manjša od aktivnosti skupin, ki so kovalentno vezane direktno na skelet monolita. Navedena opažanja omogočajo bolj natančno napovedovanje adsorpcije in posledično lažjo ter predvsem učinkovitejšo uporabo tovrstnih nosilcev v procesih čiščenja. Pomemben prispevek na področju znanosti je tudi možnost hidrotermalne sinteze rutilnih dvojčkov, kar bi lahko v bodočnosti privedlo do popolnoma nove generacije konvektivnih nosilcev, uporabnih tako v zaključnih procesih kot tudi precej širše kot npr. pri katalizi. Eksperimenti na področju bakteriofagov so pokazali, da jih je mogoče učinkovito gojiti tudi v kontinuirnih procesih, še posebej pomembna pa je možnost, da z optimizacijo pogojev lahko dosegamo vsaj dvakrat višjo maksimalno specifično hitrost rasti bakterije Campylobacter, kot je bila dosedaj opisana v literaturi. Pomembno ugotovitev predstavlja tudi dejstvo, da so tudi pri visokotlačni tekočinski kromatografiji strižne sile dovolj nizke, da ne pride do razpada VLP-jev.
Pomen za razvoj Slovenije
Razviti postopki na osnovi monolitnih kromatografskih nosilcev omogočajo izjemno hitro in učinkovito pridobivanje zadostnih količin bakteriofagov in VLP-jev s čistostjo primerno za humano uporabo. Hitrost pri njihovem pridobivanju je, poleg zagotavljanja zadostne količine, pomembna predvsem ob izbruhu epidemij, ko je pomemben vsak dan, za preprečevanje nadaljnjega širjenja okužbe s čimer v primeru epidemije s smrtonosnimi bakterijami tudi drastično zmanjšamo število človeških žrtev. Z razvojem novih procesov čiščenja temelečih na konvektivnih metakrilatnih kromatografskih nosilcih, dosegamo povečanje produktivnosti za cel velikostni red, prav na osnovi pospešitve procesa izolacije. Zaradi nizkega potrebnega števila korakov izolacije, pa so razviti nosilci in procesi, ki na njih temeljijo, pomembni tudi zaradi pridobivanju zadostnega števila bakteriofagov in VLP-jev, kot nadomestkov za antibiotike oziroma cepiv, po nizki ceni. To omogoča njihovo dostopnost bistveno večjemu številu ljudi po celem svetu. Zaradi navedenega imajo uspešni rezultati projekta velik pomen za zdravje ljudi na splošno, seveda pa njihova aplikacija v prakso pomeni dodano vrednost za sofinancerja projekta, saj povečuje dodano vrednost in s tem lažje doseganje večjega tržnega deleža ter posledično večje število delovnih mest ter s tem slovenskemu gospodarstvu.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
