Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Vzpostavitev čebeljih celičnih linij in standardiziranih in vitro testov za oceno škodljivih učinkov strupov in okužb na čebele

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
4.02.00  Biotehnika  Živalska produkcija in predelava   

Koda Veda Področje
B400  Biomedicinske vede  Zootehnika, živinoreja, vzreja 

Koda Veda Področje
4.02  Kmetijske vede in veterina  Znanost o živalih in mlekarstvu 
Ključne besede
čebele, čebelje celične linije, kemikalije, metabolne motnje, izražanje genov
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (16)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  07914  dr. Dušan Benčina  Veterina  Raziskovalec  2014 - 2016  223 
2.  33147  dr. Luka Bolha  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2016  25 
3.  11169  dr. Janko Božič  Biologija  Raziskovalec  2013 - 2016  320 
4.  29430  dr. Ivanka Cizelj  Biotehnologija  Raziskovalec  2013 - 2015  51 
5.  34506  dr. Manuela Čitar  Mikrobiologija in imunologija  Raziskovalec  2016  19 
6.  05098  dr. Peter Dovč  Biotehnologija  Raziskovalec  2013 - 2016  935 
7.  25530  dr. Petra Draškovič  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2013 - 2014  59 
8.  18324  dr. Gordana Glavan  Nevrobiologija  Raziskovalec  2013 - 2016  144 
9.  24769  dr. Gregor Gorjanc  Živalska produkcija in predelava  Raziskovalec  2013 - 2016  496 
10.  10448  dr. Aleš Gregorc  Živalska produkcija in predelava  Raziskovalec  2014 - 2016  500 
11.  06537  dr. Dragomir Kompan  Živalska produkcija in predelava  Raziskovalec  2013 - 2016  740 
12.  24503  dr. Peter Kozmus  Biologija  Raziskovalec  2013  324 
13.  05008  dr. Mojca Narat  Biotehnologija  Vodja  2013 - 2016  688 
14.  24298  dr. Irena Oven  Živalska produkcija in predelava  Raziskovalec  2013 - 2016  81 
15.  27547  dr. Zala Prevoršek  Živalska produkcija in predelava  Raziskovalec  2013 - 2016  42 
16.  19626  Rok Štravs  Biotehnologija  Raziskovalec  2015 - 2016  18 
Organizacije (3)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0158  BIA podjetje za laboratorijsko in procesno opremo d.o.o. Ljubljana  Ljubljana  5327601  18 
2.  0401  Kmetijski inštitut Slovenije  Ljubljana  5055431  20.373 
3.  0481  Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta  Ljubljana  1626914  66.215 
Povzetek
Izhodišča: Gojenje celic in vitro, je nepogrešljiva tehnologija, ki omogoča proučevanje mehanizmov, ki potekajo in vivo. Na osnovi celičnih kultur so razviti tudi številni citotoksični testi,  ki so v primerjavi s testi in vivo, cenejši, hitrejši, bolj standardizirani in sledijo načelu 3R. V svetu in pri nas se srečujemo z obsežno problematiko poginov čebel. Vzroke iščemo med čebeljimi patogeni in predvsem med kemikalijami, s katerimi prihajajo čebele v stik: zaščitna kmetijska sredstva (FFS), zaščitna sredstva proti čebeljim škodljivcem, okoljski polutanti. Čebele imajo izjemno pomembno vlogo v ekosistemu, saj z opraševanjem prispevajo k proizvodnji velikega deleža hrane. Da bi uspešno in pravočasno rešili problem propadanja čebel, moramo najprej razumeti vzroke poginov čebel. Proučiti moramo motnje v celičnih metabolnih poteh ter molekularne mehanizme delovanja kemikalij in patogenov na celičnem in genetskem nivoju.  Za to potrebujemo ustrezno metodologijo in vzpostavitev trajnih celičnih kultur iz različnih čebeljih tkiv je prvi korak, pomemben tudi za  vzpostavitev standardiziranih in vitro  testov. Predstavitev problema: Intenzivna pridelava poljščin zahteva uporabo FFS oz. kemikalij, ki imajo v določenih okoliščinah lahko negativne učinke tudi na netarčne organizme, npr. na čebele. Nepoznane so posledice dolgotrajne izpostavljenosti nizkim, predvidoma neškodljivim, dozam in posledice hkratne ali zaporedne uporabi več kemikalij, učinkov kemikalij v kombinaciji s sredstvi za zaščito čebel ali učinkov kemikalij na okužene čebele. Evropska komisija poziva vse članice k intenzivnim laboratorijskim raziskavam na področju zaščite čebel. Evropski raziskovalci ugotavljajo, da je kritično pomanjkanje standardiziranih metod in zato pozivajo k razvijanju celičnih linij, na katerih bi bilo možno izvajati ponovljive raziskave v kontroliranih pogojih. V projektu bomo sistematično proučili možnosti za vzpostavitev čebeljih celičnih kultur iz različnih organov. Posebnost našega pristopa je v uporabi fenotipskih mikromrež za optimizacijo gojitvenega medija, ki doslej predstavlja omejitveni faktor. V nadaljevanju bomo z lentivirusno transdukcijo vnesli v celice onkogene in tako pripravili trajne celične kulture. Na primarnih in trajnih celičnih kulturah bomo nato testirali učinke izbranih kemikalij na celičnem nivoju ter na nivoju metabolizma in izražanja genov. Enake poskuse nameravamo izvesti s kombinacijami kemikalij, ki se pojavljajo v naravnem okolju in oceniti, kakšni so skupni učinki. Cilji in pričakovani rezultati: a) vzpostavitev primarnih in trajnih celičnih linij iz različnih tkiv čebel in iz različnih razvojnih stopenj; b) optimizacija gojitvenih medijev c) identifikacija sprememb v izražanju genov ob prisotnosti kemikalij in/ali patogenov; d) identifikacija mehanizmov, ki vodijo v celično smrt ob prisotnosti kemikalij in/ali patogenov; e)identifikacije sprememb v metabolnih poteh, ki jih povzroči prisotnosti kemikalij in/ali patogenov; f)definirati značilne spremembe (markerske gene, metabolne poti) in na podlagi le teh vpeljati in vitro teste na celičnih kulturah; g)aplikacija:izdelati posebno fenotipsko mikromrežo, specifično za čebele in razviti test za oceno škodljivih učinkov kemikalij. Relevantnost rezultatov: Vzpostavitev čebeljih celičnih linij je v skladu s pozivi in direktivami EU in bo pomenila prispevek in napredek v mednarodnem merilu in omogoča povezovanje z mednarodnimi projekti (COLOSS network, IBRA,itd). Raziskava bi pomenila doprinos k razumevanju delovanja kemikalij in omogočila realne ocene nevarnosti uporabe insekticidov v različnih pogojih in kombinacijah. Usposobljenost skupine: Nekaj članov se že ukvarja s problematiko poginov čebel, večina članov in institucija prijaviteljica pa s tem projektom začenja novo področje raziskav. Prepričani smo, da to ni ovira, saj teh raziskav v SLO ne izvajamo še, so pa nujne in smo za to usposobljeni. Za vse predlagane metode imamo reference in razpoložljivo opremo.
Pomen za razvoj znanosti
Propad čebel in čebeljih družin je prisoten povsod po svetu, hkrati je pritisk kemične industrije z vedno novimi produkti vedno večji. Vzpostavili smo nekaj tipov dolgotrajnih celičnih čebeljih linij, kar je v skladu s pozivi in direktivami EU in pomeni prispevek in napredek na področju raziskovanja in reševanja problematike pomorov čebel na subcelularnem nivoju z uporabo celičnih kultur v izogib poskusom na živalih samih. Vzpostavili smo standardizirane protokole za pripravo celičnih kultur iz različnih tkiv in razvojnih faz čebel in s tem sistematično pristopili k vzpostavitvi celičnih linij iz različnih tkiv in optimizacije gojišč. Iz tega dela je v pripravi objava članka v mednarodni reviji, kar bo omogočilo pripravo dolgotrajnih celičnih tudi drugim raziskovalnim skupinam. Predstavitev vzpostavitve celične linije na mednarodnem kongresu EurBee 2016 je namreč požela veliko zanimanja, ker več skupin že več let išče ustrezen model in na podlagi tega smo vzpostavili tudi nova sodelovanja s tujimi inštitucijami. Kljub temu, da zaenkrat še nismo uspeli vzpostaviti trajne celične linije, smo vzpostavili dolgotrajne kulture, ki omogočajo začetek pri vzpostavitvi in vitro testov za oceno tveganja škodljivih učinkov pesticidov in patogenih okužb na čebele, hkrati pa omogočajo nadaljnje raziskave tudi na nivoju izražanja genov v normalnem stanju in v stanjih po različnih tretmajih s kemikalijami in/ali okužbami v kontroliranih in standardiziranih laboratorijskih pogojih, kar je ključno za validacijo testov. Optimizirali smo tudi gojitvene medije za celične kulture iz različnih tkiv, kar je trenutno največja ovira pri gojenju čebeljih celic in s tem doprinesli tudi k bazičnem znanju o gojenju čebeljih celic. Z realno oceno učinkov kemikalij in okužb s patogeni na izražanje genov pri posameznih razvojnih stopnjah čebel, smo doprinesli novo bazično znanje, ki smo ga objavili v mednarodnih znanstvenih revijah. S poznavanjem vseh genov in molekularnih poti, katerih izražanje se spreminja pod vplivom kemikalij/okužb s patogeni, bi lahko uvedli nove standarde pri zaščiti čebel. Glede na to, da je podatkov o delovanju kemikalij in/ali patogenov na čebele izjemno malo in so pridobljeni na različne načine, neprimerljivi in razpršeni, ocenjujemo, da je tak sistematičen pristop nujen in bo omogočil napredek pri reševanju pereče problematike poginov čebel v slovenskem in mednarodnem merilu. Možnost standardiziranega proučevanja medsebojnih učinkov kemijskih substanc, ki se uporabljajo v kmetijstvu in pri zaščiti čebel ter drugih kemikalij iz okolja, na celičnem nivoju bi dala neprecenljiv napredek, saj bi s simulacijami kontroliranega okolja (od substanc do temperatur) lahko proučili kombinacijo učinkov, ki se izkažejo kot faktorji vpliva. Seštevanje in kombinacija učinkov, ki se izražajo kot vplivi na celične kulture, bodo dali odgovore, za katere bi v naravnem okolju potrebovali verjetno večkratnik časa, da bi dobili podobne odgovore. S tega vidika si obetamo napredek pri proučevanju različnih vplivov, ki so pomembni za razumevanje delovanja v naravnem okolju. Tudi ocenitev sinergističnih učinkov delovanja več kemikalij je zelo pomembna za razumevanje problematike zdravja čebel – čebela lahko namreč leti do 7 km daleč in se tako hrani na različnih poljščinah, s tem pa potencialno pride v stik z več pesticidi. Izsledki naše študije tako omogočajo globalni vpogled na okoljske vplive na čebele. Razumevanje dogodkov na genskem in celičnem nivoju je vedno nujna osnova za načrtovanje posegov v naravo. Če povzamemo smo z našo študijo doprinesli novo bazično znanje, ki je relevantno tako za mednarodno kot tudi za domačo strokovno javnost, hkrati pa smo sedaj korak bližje k uvedbi novih metod za testiranje škodljivih učinkov kemikalij na čebele in prenosom bazičnega znanja v uporabno prakso.
Pomen za razvoj Slovenije
Naša skupina je prva v Sloveniji, ki je uspela vzpostaviti dolgotrajne celične kulture iz čebelji celic. Zanimanje za naše kulture je že pokazalo več raziskovalnih skupin, ki se ukvarjajo s čebelami. Pripravljene kulture čebeljih celic bi lahko uporabili za vzpostavitev in vitro testov za oceno tveganja fitofarmacevtskih sredstev, predvsem v smislu ocene sinergističnih učinkov med že obstoječimi kemikalijami v okolju in novimi kemikalijami, ki jih proizvajalci skušajo plasirati na trg, kar bi bilo zanimivo tako za zakonodajalce kot tudi za gospodarstvo. Tako bi lahko »nove« produkte za zaščito rastlin (insekticide, pesticide in druge kemikalije) testirali na nivoju celičnih kultur in na ta način dobili hitrejše rezultate in odgovore ter omogočilo državi (MKO, FURS, VURS), da uporabo takih novih kemijskih sredstev odobri oziroma ne odobri. To bi vodilo k zmanjšanju tveganj na tem področju. Poznavanje mehanizmov delovanja kemikalij je osnova za reševanje problematike poginov čebel. Zaradi dolge tradicije čebelarjenja s kranjsko čebelo, ki ima nezamenljivo vlogo pri zagotavljanju velikega deleža hrane za ljudi, smo v Sloveniji dolžni ohraniti ta pomemben genetski potencial, ki predstavlja tudi pomemben del naše naravne in kulturne dediščine ter biotske raznovrstnosti. Kranjska čebela (Apis Mellifera Carnica) je avtohtona in zaščitena čebelja rasa v Sloveniji. Ocenjujemo, da bodo rezultati tega projekta bistveno pripomogli k sprejemanju ukrepov, ki bodo temeljili na konkretnih znanstvenih rezultatih. Na nivoju države (državne uprave) izkazujeta interes za reševanje problematike poginov čebel: MKO (MKGP) in njegov Svet za živinorejo ter priznana rejska organizacija v čebelarstvu - Čebelarska zveza Slovenije. Z rezultati bomo seznanili vse deležnike, tudi Fitosanitarno upravo RS (FURS), saj menimo, da bi bilo nujno uvesti rutinska dodatna testiranja za oceno tveganja kemikalij (FFS). Kot člani Komisije za genetske resurse za kmetijstvo in prehrano (CGRFA Comission for Genetic Resources for Food and Agriculture) in evropske regionalne točke za genetske vire (ERFP – European Regional Focal Point for Gentic Resources) smo še posebej vpleteni v aktivnosti ohranjanja in zaščite avtohtonih pasem (podvrst) živali. Dobljeni rezultati so objavljeni v priznanih mednarodnih znanstvenih revijah in so bili predstavljeni na mednarodnih znanstvenih konferencah (EUR-BEE, COLOSS), s čimer doprinašamo k prepoznavnosti raziskovalcev, skupine in mednarodni promociji države. Nenazadnje smo vključeni v pedagoški proces na Biotehniški fakulteti, kjer so rezultati naše raziskave redno predstavljeni v okviru seminarjev in pogosto uporabljeni primeri na vajah ter kot konkretne raziskave in rezultati uporabljeni v okviru predavanj.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Letno poročilo 2014, 2015, zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Letno poročilo 2015, zaključno poročilo
Zgodovina ogledov
Priljubljeno