Projekti / Programi
Nova tehnologija za pridobivanje novih poliketidnih vodnic s kemijsko reaktivnimi skupinami
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.01 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
Tehnologija rekombinantne DNA |
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.09 |
Tehniške in tehnološke vede |
Industrijska biotehnologija |
Poliketidi, poliketid sintaze, aciltransferaza, biosintezni inženiring, odkrivanje novih učinkovin
Raziskovalci (15)
Organizacije (2)
Povzetek
Poliketidi so velika skupina biogenetsko sorodnih naravnih produktov, ki jih sintetizira raznolika skupina encimov poliketid sintaz (PKS). Poliketidi so strukturno izjemno raznoliki, kar se odraža v širokem spektru različnih farmakoloških aktivnosti, posledično pa tudi v njihovem velikem kliničnem in industrijskem pomenu. Zaradi vse pogostejše odpornosti patogenih bakterij, neoptimalnih farmakoloških lastnosti in neželenih stranskih učinkov trenutnih zdravil je razvoj novih spojin ter učinkovitejših zdravil nujen. Polsintezna derivatizacija naravnih spojin je že privedla do številnih klinično uspešnih molekul, vendar pa je v strukturi poliketidov število funkcionalnih skupin, dostopnih za kemijsko modifikacijo omejeno, zato je razvoj novih polsinteznih poti po vseh teh letih izčrpan. S pomočjo biosinteznega inženiringa encimov PKS, še posebej PKS tipa I, so se možnosti razvoja novih molekul razširile. Ti encimi so organizirani modularno, pri čemer vsak ima modul več encimskih domen in katalizira po en korak podaljševanja poliketidne verige, podobno kot pri biosintezi maščobnih kislin. Z zamenjavo domen v posameznem modulu lahko dosežemo spremembe poliketidnih struktur. Pogosto so pri tovrstnih spremembah uporabili zamenjavo acil transferaznih (AT) domen, saj te pri biosintezi poliketida določajo izbiro podaljševalnih enot. V poliketide se vključujejo skoraj izključno podaljševalne enote malonil-, metilmalonil- in etilmalonil-CoA, zaradi česar je strukturna raznolikost končnih molekul omejena. Te omejitve tudi z biosinteznim inženirstvom niso rešili, saj so skoraj vsi uspešni poskusi zamenjave AT vodili do odstranitve ali dodatka metilne ali etilne skupine na obstoječi poliketidni molekuli. Takšni derivati večinoma niso pokazali izboljšanih farmakoloških lastnosti. Po drugi strani pa zaradi kemijske nereaktivnosti (inertnosti) metilne skupine ni bila možna niti nadaljnja polsintezna derivatizacija. Pred kratkim smo odkrili, da lahko nenavadna AT domena modula 4 iz PKS imunosupresiva FK506 (fkAT4) v poliketidno verigo vključuje nenavadne gradnike s kemijsko reaktivnimi terminalnimi dvojnimi in trojnimi vezmi, kot tudi druge nenaravne podaljševalne enote (še neobjavljeno). Še več, omenjena AT domena ne vključuje splošno dostopnih malonil-CoA in metilmalonil-CoA. Nenavadna speficičnost/selektivnost fkAT4 domene tako predstavlja edinstven potencial za biosintezni inženiring poliketidov. Zato predlagamo razvoj nove tehnološke platforme, ki bo omogočila vnos kemijsko reaktivnih skupin na različnih lokacijah praktično katerega koli poliketida tipa I. To bi bistveno povečalo možnosti za nadaljnjo polsintezno derivatizacijo in razvoj povsem novih ter kemijsko zelo raznolikih struktur. Pri delu se bomo poslužili tudi komparativne analize in 3D modeliranja AT domen in tako pridobili dodaten vpogled v specifičnost nenavadne domene fkAT4, hkrati pa bomo pri konstrukciji hibridnih PKS genov lažje izbrali optimalna mesta za povezovanje domen. Temu bo sledila “in vitro” biokemijska analiza izoliranih proteinov, ki bodo vsebovali samostojno domeno fkAT4, ali pa skupaj z preostalimi domenami modula. Pri testiranju bomo uporabili različne sintetične derivate podaljševalnih enot. Hkrati bomo izvajali tudi "in vivo" analize funkcionalnosti novih hibridnih PKS genov, ki bodo temeljili na izbranih modelnih sistemih: PKS eritromicina in njegove skrajšane verzije DEBS1-TE, v katere bomo vnesli domeno fkAT4. S pomočjo kemobiosinteznega pristopa ter hibridnih PKS bomo pripravili nove analoge. Ustvarili bomo tudi nove različice domene fkAT4, za kar bomo uporabili mestno specifično in naključno mutagenezo, ter tako skušali dodatno optimizirati njeno specifičnost. Cilj predlaganega projekta bo razviti in prikazati potencial predlagane tehnološke platforme, ki jo bomo lahko uporabljali za derivatizacijo številnih medicinsko pomembnih poliketidnih učinkovin oziroma pripravo novih analogov s kemijsko reaktivnimi skupinami.
Pomen za razvoj znanosti
Biosintezni inženiring PKS encimov in naknadna polsintezna derivatizacija proizvedenih spojin je v preteklosti že omogočila razvoj novih biološko aktivnih učinkovin oziroma vodnic za razvoj nova zdravila. Vendar je naše razumevanje programiranja PKS še vedno omejeno, kar se nanaša predvsem na mehanizem specifičnosti/selektivnosti aciltransferaznih (AT) domen, ki definirajo izbor podaljševalih enot, s čimer bomo lahko učinkoviteje razvijali nove vodnice z izboljšanimi farmakološkimi lastnostmi. V sklopu tega projekta smo se osredotočili predvsem na preučevanje specifičnosti aciltransferaz (AT), ki so ključne domene vsakega PKS modula, saj določajo izbor podaljševalnih enot in tako ključno vplivajo na kemijsko strukturo sintetiziranih poliketidnih molekul. Zelo omejena raznovrstnost podaljševalnih enot, ki jih uporabljajo PKS encimi v biosintezi PKS verige, in še posebno njihova kemijska »inertnost« za pristope polsintezne kemije, je velika slabost biosintezne mašinerije PKS in odgovarjajočih struktur. In prav to je bil osnovni namen izvedenega projekta, da v »arsenal« podaljševalnih enot vnesemo bolj raznolike gradbene enote, ki so tudi bolj prikladne za pol-sintezne modifikacije, ki omogočajo večjo diverzifikacijo spojin, kar nam je v enem od izbranih PKS sistemov (platform) tudi uspelo z uporabo pristopov kemobiosinteze. Čeprav so v preteklosti različna podjetja in raziskovalne inštitucije že investirali veliko naporov v preučevanje selektivnosti AT domen, vključno s poskusi nekaterih vodilnih svetovnih inštitucij, resnega premika na tem področju ni bilo. Tudi v preteklih treh letih, v času izvajanja tega projekta, so nekatere konkurenčne inštitucije v Nemčiji, ZDA in Južni Koreji poskušale reševati problem raznolikosti gradbenih enot z encimi PKS, v čem so bile te raziskovalne skupine večinoma neuspešne. V naših lastnih pristopih, ki se bistveno razlikujejo, pa nam je v primeru platforme s sevom S. tsukubaensis res uspel preboj, saj smo pripravili prvo spojino v z zavidljivim donosom, ki ima v svoji strukturi gradbeno dojemljivo do pristopov polsintezne kemije. V zadnjih letih smo v naši raziskovalni skupini intenzivno preučevali in razkrili novo in edinstveno biosintezno pot udeleženo v biosintezi nenavadne podaljševalne enote alilmalonil-CoA, ki jo v molekulo FK506 vgrajuje AT4 domena FK506 PKS genske skupine (Goranovic s sod. 2010, Kosec s sod. 2012, US 8980585 (B2)). Na podlagi začetnih odkritij, smo v Acies Bio hitro prepoznali velik potencial te biosintezne poti za alilmalonil-CoA ter unikatnost AT domene modula 4 FK506 (fkAT4 domena). Poskusi, ki smo jih izvajali v heterolognem sistemu S. erythraea na žalost niso dali zadovoljive rezultate, podobno, kot so to ugotovili tudi raziskovalci v Nemčiji (Klopries et al., 2015). Naši eksperimenti pa nakazujejo, da AT domena ni edina, ki vpliva na selektivnost in procesivnost tega kompleksnega sistema (Blažič s sod 2015). Podaljševanje verige na modulu 4 FK506 PKS verjetno ne poteka preko CoA-aktiviranih podaljševalnih enot malonatov, ampak direktno preko ACP-vezanih oblik. Naše raziskave kažejo, da bi bilo verjetno potrebno prenesti celoten encimski sistem za biosintezo nenavadne gradbene enote iz FK506 v industrijski sev S. erythraea (Karničar s sod., 2016) , kar pa ni enostavna naloga. Po drugi strani pa se je kemobiosintezni postopek in platforma v S. tsukubaensis pokazala kot produktivna, in nam je verjetno prvič v zgodovini uspelo pripraviti poliketidni produkt z trojno vezjo v zadovoljivih količinah z kemobiosinteznim pristopom, ki ga je mogoče prenesti v industrijsko merilo. K temu je bistveno prispevalo dodatno razumevanje ozadja biosinteze nenavadnih gradbenih enot v S. tsukubaensis (Blažič s sod., 2015). V času poteka tega projekta smo uspeli ovrednotiti in prilagoditi novo platformo in proizvesti eno vodnico na osnovi imunospuresorja FK506, ki kaže zelo zanimivo aktivnost, in tako bistveno poglobili razumevanje delovanja tega kompleksnega encimskega sistema.
Pomen za razvoj Slovenije
Glede na velik medicinski in industrijski pomen številnih aktivnih učinkovin na osnovi poliketidov, katerih skupni trg trenutno presega 50 milijard USD, ne preseneča, da je bilo v preučevanje biosinteze poliketidov v preteklosti vloženega že veliko truda. Poliketidi imajo izjemno širok spekter bioloških aktivnosti in se intenzivno uporabljajo v medicini in kmetijstvu. Predvsem na področju antiinfektivov, imunomodulacije in delovanja proti raku je še vedno velika potreba po razvoju bolj učinkovitih terapij in večje število zdravil na osnovi poliketidov je trenutno v kliničnih preiskavah. Za Slovenijo je to področje izjemnega pomena, saj oba Slovenska farmacevta, Lek/Sandoz in Krka proizvajata številna zdravila na osnovi teh učinkovin. Je pa to področje ključnega pomena tudi za Acies Bio, ki se ukvarja z razvojem tako generičnih kot inovativnih tehnologij za proizvodnjo tovrstnih farmacevtskih aktivnih učinkovin, bodisi kot servis veliki farmacevtski in biotehnološki industriji doma in po svetu ali pa v okviru lastnih razvojnih projektov na področju razvoja novih bioprocesov in novih biološko aktivnih učinkovin. V tem trenutku Acies Bio aktivno dela na dveh skupinah biološko aktivnih učinkovin, ki se nanašajo na zdravljenje bakterijskih infekcij, protirakastih učinkovin in redkih nevrodegenerativnih bolezni. V sklopu tega triletnega projekta je Acies Bio uspel razviti novo platformo, ki bo omogočala razvoj popolnoma novih matric, ki jih z obstoječimi tehnologijami ni bilo mogoče pridobivati. Ena od vodnic, na osnovi FK506, ki smo jo proizvedli kaže zelo zanimivo biološko aktivnost, še posebno pa izstopa nizka toksičnost, v primerjavi z izhodno spojino. Ta učinkovina se sedaj testira v sodelovanju s inštitutom Helmholtz (Nemčija), kar bo predvidoma zaključeno do julija 2017. Predlagana tehnološka platforma predstavlja novo priložnost za razvoj novih strukturnih matric na osnovi obstoječih in klinično dokazanih in uspešnih poliketidov, poliketidov vodnic, ki so trenutno v kliničnih testih, ali pa obetavnih molekul, ki niso napredovale v klinične teste zaradi potencialnih neželenih stranskih učinkov. Tehnologijo bomo lahko uporabili za razvoj pomembnih novih zdravil oz. vodnic z bistveno izboljšanimi farmakološkimi in terapevtskimi lastnostmi, kar bo doprineslo tako širši družbi in zdravju kot tudi konkurečnosti slovenske biotehnološke in farmacevtske industrije. Nova tehnološka platforma omogoča pomemben tehnološki napredek in dvig globalne konkurečnosti sofinancerju projekta, biotehnološkemu podjetju Acies Bio. Izvedba projekta je vključevala angažiranje v mednarodnem raziskovalnem prostoru in interdisciplinarno raziskovalno skupino, ki je vključevala biologe, mikrobiologe, sintezne kemike in strukturne biologe. Postavljena skupina bo s sodelovanjem nadaljevala, saj predstavljala tudi odlično platformo za prenos znanja in tehnologij med akademijo in industrijo. V obsegu financiranja predlaganega raziskovalnega projekta smo izvajali tudi izobraževanje mladih raziskovalcev in podoktorskih raziskovalcev, ki so v času izvedbe tega projekta sodelovali z dinamičnim biotehnološkim podjetjem Acies Bio. Novo znanje in ekspertize ter konkurenčna prednost, ki smo jih pridobili in še vedno poteka v obsegu lastnega financiranja Acies Bio, bodo omogočili tudi ustrezne pogoje za nadaljni razvoj Slovenije kot družbe. Na osnovi rezultatov izvedenega projekta pričakujemo že v tem letu novo objavo v mednarodni strokovnih reviji visokega faktorja vpliva in konferencah, in bomo tako s tem dodatno prispevali k promociji slovenske znanosti na področju razvoja novih zdravil.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2013,
2014,
2015,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2013,
2014,
2015,
zaključno poročilo
